Name: oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00
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이 연구는 한국 정부가 후원하는 한국 연구 재단 (National Research Foundation for Korea) (No. 2015R1A2A1A10052663 및 No. 2014M1A3A3A02034698)의 지원을 받았다.

1. 안전 주의 :이 프로토콜은 [γ- 32 P] -ATP를 사용하여 AMPK의 활성을 평가합니다. Phosphorus-32는 방사성 동위 원소로 주로 베타 방사선을 방출합니다. 베타 입자의 크기가 매우 작기 때문에 쉽게 의류와 피부에 침투 할 수 있습니다. 베타 방사선에 대한 외부 및 내부 노출은 피부 화상과 조직 손상을 유발하는 것을 포함하여 인체 건강에 해로울 수 있습니다. <ol><li> 아크?...

<ol>
	<li>Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK:+An+energy-sensing+pathway+with+multiple+inputs+and+outputs.">AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs.</a> Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).</li><li>Gwinn, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylation+of+raptor+mediates+a+metabolic+checkpoint.">AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint.</a> Mol Cell. 30, 214-226 (2008).</li><li>Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Nrf2+at+Ser-40+by+protein+kinase+C+regulates+antioxidant+response+element-mediated+transcription.">Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription.</a> J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).</li><li>Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant-induced+modification+of+INrf2+cysteine+151+and+PKC-delta-mediated+phosphorylation+of+Nrf2+serine+40+are+both+required+for+stabilization+and+nuclear+translocation+of+Nrf2+and+increased+drug+resistance.">Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance.</a> J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).</li><li>Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3beta+acts+upstream+of+Fyn+kinase+in+regulation+of+nuclear+export+and+degradation+of+NF-E2+related+factor+2.">GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2.</a> J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).</li><li>Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry:+myths,+facts,+and+the+consequences+for+qualitative+and+quantitative+measurements.">Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).</li><li>Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+phosphorylation+sites:+a+quick+guide+for+cell+biologists.">Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists.</a> Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).</li><li>Joo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+facilitates+nuclear+accumulation+of+Nrf2+by+phosphorylating+at+Serine+550.">AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550.</a> Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).</li><li>Sinclair, W. K., Holloway, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half-lives+of+some+radioactive+isotopes.">Half-lives of some radioactive isotopes.</a> Nature. 167 (4244), 365 (1951).</li><li>Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Src+and+RACK1+is+enhanced+by+activation+of+protein+kinase+C+and+tyrosine+phosphorylation+of+RACK1.">The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1.</a> J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).</li><li>Smith, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RACK1+interacts+with+filamin-A+to+regulate+plasma+membrane+levels+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).</li></ol>

AMPK에 의해 매개되는 예측 된 인산화 부위의 신뢰성을 평가할 수있는 간단하고 편리한 방법으로 경쟁 펩타이드를 사용하여 특정 인산화 부위를 발견하고 부위 특이 적 돌연변이 체를 사용하여이를 검증 할 수있는 in vitro 키나아제 분석 에 대해 설명합니다 . 시험관 내 경쟁 AMPK 활성 분석 에서 얻은 대표적인 데이터는 펩타이드 경쟁 분석이 인산화 부위를 결정하는 유용...

특정 잔기에서의 단백질 인산화는 광범위한 세포 과정에서 중요한 역할을합니다. 따라서, 신호 전달 네트워크의 이해는 특정 인산화 부위의 확인을 필요로한다. 또한, 인산화 부위는 단백질 내의 개별 도메인이 상이한 구조 및 기능을 보유하기 때문에 단백질 기능에 대한 효과를 결정한다. 주요 항산화 인자 인 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2 (Nrf2)의 활성은 다른 부위의 인산화를 통해 양방향으로 조절된다. 우리의 연구는 Nrf2의 인산화를 촉매하는 키나아제에 초점을 맞추었다. 산화 적 공격에 대한 Nrf2의 스트레스 반응은 주로 세린 40에서의 인산화와 Nrf2를 활성화시키는 protein kinase C (PKC) -δ를 통해 빠르게 일어난다. 반대로, Fyn은 티로신 5에서 Nrf2의 억제 성 인산화를 촉매한다활동의 긴밀한 통제를 위해 68. 인산화 부위를 발견하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법은 액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 (LC / MS) 분석입니다. 신속하고 매우 민감한 인산화 부위 맵핑 데이터는 이러한 방식으로 생성 될 수있다. 그러나 몇 가지 기술적 인 한계가 있으며 가끔 잘못된 신호를 생성합니다. 열악한 서열 범위는 종종 LC / MS 분석에서 발생합니다. 인산화 부위를 확인하기 위해서는 단백질의 최대 아미노산 범위에 대한 정보가 필요합니다 6 . 소화 단계에서 여러 단백질 분해 효소로 단백질을 단백질 분해하면 서열 범위를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인산화 잔기의 확인에 대한 또 다른 장애는 세린 및 트레오닌 인산화 된 펩타이드 6 , 7에서 자주 관찰되는 인산의 손 상 손실입니다. 불안정한 인산염 잔기는 종종단편화 과정에서 인산 펩타이드로부터 방출된다. 인산화 부위를 검색 할 때 두 번째 옵션은 펩타이드 마이크로 어레이 방법을 사용하는 것입니다. 목적 단백질로부터 유래 된 펩티드 단편을 함유하는 마이크로 어레이 칩을 사용하여 키나아제 표적 부위를 스크리닝하는 것이 가능하다. 그러나, 마이크로 어레이 칩의 생산 및 검출을위한 장비 요건으로 인해, 펩타이드 마이크로 어레이 방법은 시간 소모적이고 고비용으로 고려된다. 이러한 과제를 극복하기 위해, 시험 관내 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석은 공지 된 인식 모티프를 갖는 단백질 키나아제에 사용될 수있다. 키나아제의 공통 인식 모티프가 확립되면, 후보 기질의 추정 인산화 부위가 예측 될 수 있고, 그 부위의 진위가 확인 될 수있다. 이 과정에서 가장 설득력있는 방법은 돌연변이 단백질에서 인산화의 폐지를 보여주는 것이다.d 잔기는 비 - 인산화 가능한 아미노산 ( 즉, 세린 또는 트레오닌 내지 알라닌; 티로신 내지 페닐알라닌)으로 치환된다. 그러나, 돌연변이 단백질의 생산 및 분리는 시간 소모적이다. 연구 초기 단계의 대안으로 경쟁 펩타이드 키나아제 분석은 간단하고 편리합니다. 여기, 우리 는 체외 펩티드 경쟁 분석 및 인산화 사이트의 검증을위한 프로토콜을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Calbiochem, Nottingham, UK</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK</td>
			<td>Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY</td>
			<td>14-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2 (WT)</td>
			<td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td>
			<td>H00004780-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[&#947;-32P]-ATP</td>
			<td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZblue staining reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu turbo DNA polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>600250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>200415-51</td>
			<td>Avoid multiple thaw and freezing cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>L1704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td>
			<td>11259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea</td>
			<td>32034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td>
			<td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td>
			<td>QDF100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td>
			<td>BSA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid glacial</td>
			<td>Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol</td>
			<td>Daejung Chemicals &#38; Metals, Siheung, South Korea</td>
			<td>5558-4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>28-9558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-1746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dancing shaker</td>
			<td>FINEPCR, Seoul, Korea</td>
			<td>CR300</td>
			<td>The machine is needed for washing step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shakers</td>
			<td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td>
			<td>NB-205L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>LABOGENE, Seoul, Korea</td>
			<td>1730R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>732-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination

특정 부위의 단백질 인산화가 다른 분자와의 형태 및 상호 작용을 결정합니다. 따라서 단백질 인산화는 세포의 생물학적 기능과 특성에 영향을 미친다. 현재, 인산화 부위를 발견하는 가장 일반적인 방법은 신속하고 민감한 방법 인 액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 (LC / MS) 분석입니다. 그러나, 상대적으로 불안정한 인산염 잔기는 단편화 단계에서 종종 포스 포 펩타이드로부터 방출되며, 이는 종종 거짓 음성 신호를 생성한다. 그러한 경우, 부위 특이 적 돌연변이 체를 이용한 전통적인 in vitro 키나아제 분석이 더 정확할 수 있지만,이 방법은 힘들고 시간 소모적이다. 따라서, 펩티드 경쟁을 이용하는 대안적인 방법이 유리할 수있다. 5 &#39;아데노신 모노 포스페이트 - 활성화 단백질 키나아제 (AMPK)의 컨센서스 인식 모티프가 확립되었고, 위치 스캐닝 펩타이드 라이브러리 엉덩이를 사용하여 확인되었다ay 2 . 따라서, 새로운 기질에 대한 AMPK 인산화 부위는 펩티드 경쟁 분석에 의해 예측되고 확인 될 수있다. 이 보고서에서 우리는 AMPK 매개 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2 (Nrf2) 인산화를 설명함으로써 시험 관내 올리고 펩타이드 경쟁 키나아제 분석을위한 상세한 단계 및 절차를 기술한다. 인산화 부위를 인증하기 위해, 우리는 부위 특이 적 돌연변이 체를 사용하여 순차적 인 in vitro 키나아제 분석을 수행했다. 전반적으로, 펩티드 경쟁 분석은 다수의 잠재적 인 인산화 부위를 스크리닝하고 인산화 부위 돌연변이 체에 의한 확인을위한 부위를 확인하는 방법을 제공한다.

그림 1 과 그림 2 는 이전에보고 된 논문 8 에서 반복 된 실험 결과를 보여줍니다. 상응하는 AMPK 표적 부위를 모방 한 3 개의 상이한 10 잔기 올리고 펩타이드 (Ser153을 포함하는 # 1, 148-157; Ser335를 포함하는 # 2, 330 내지 339 및 Ser558을 포함하는 # 3, 553 내지 562)가 합성되어 in 시험 관내 키나아제 분석. AMPK에 의...

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Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.

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