Name: live cell imaging of chromosome segregation during mitosis
Uploaded: 2018-03-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis at JoVE.com

Nous tenons à remercier Dr Guo-Chiuan Hung et m. Bharatkumar Joshi de précieux commentaires qui ont amélioré le manuscrit.

Toutes les expériences menées dans ces études ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de l’emploi et d’institutionnels animalier dans le centre de recherche de Food and Drug Administration (FDA).
1. isolement et Culture de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs)
<ol><li>Isoler les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) d’une souche de PP2A-B56γ-souris et ceux de type sauvage par le protocole standard 7,</sup...

<ol>
	<li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+CIN:+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression.">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li><li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+issues:+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing.">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li><li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+assembly+checkpoint.">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li><li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+and+cancer:+cutting+through+the+mystery.">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis.">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li><li>Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+and+implication+of+genome+instability+in+cancer.">The detection and implication of genome instability in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).</li><li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+phosphatase+2A+B56&#947;+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development.">The protein phosphatase 2A B56&#947; regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).</li><li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP2A-B56&#947;+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint.">PP2A-B56&#947; is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites.">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).</li><li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spindle+Assembly+Checkpoint+Is+Not+Essential+for+Viability+of+Human+Cells+with+Genetically+Lowered+APC/C+Activity.">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li><li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+(hPrm1)+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures.">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li><li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine:+case+studies.">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li></ol>

Points de contrôle de contrôle cycle cellulaire qui assurent la ségrégation des chromosomes précis empêchent aneuploïdie et cell transformation 1,2,3. Dans la présente étude, nous avons trouvé que l’inactivation de PP2A-B56γ a donné lieu à un poste de contrôle de l’Assemblée broche affaibli. L’imagerie de cellules vivantes nous a permis d’observer la mis-ségrégation chromosomique au cours de la mitose ch...

Dans le protocole suivant, nous décrivons une méthode pratique pour visualiser la ségrégation chromosomique et la progression mitotique au cours du cycle cellulaire dans les fibroblastes embryonnaires de souris à l’aide d’Histone 2 b-GFP, marquage BacMam 2.0 et l’imagerie de cellules vivantes.
Points de contrôle de cycle cellulaire surveillent la ségrégation des chromosomes et jouent un rôle important dans le maintien de l’intégrité génétique de la cellule 1,2,3. Accumulation de mauvaise ségrégation chromosomes peut conduire à aneuploïdie, qui est une caractéristique de plus solides tumeurs 4. Par conséquent, détection des chromosomes traînards utilisable comme une méthode pour étudier l’instabilité chromosomique.
Fluorescent étiqueté protéines peuvent être utilisé pour visualiser la ségrégation des chromosomes vivants et chromosomiques en retard mais la génération de mCherry-tag ou protéine H2B-GFP Taggé nécessite des connaissances considérables de gène de biologie moléculaire et la livraison 5. Nous décrivons ici l’utilisation du réactif de CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, ci-après appelé regent CL-HB, par souci de simplicité. Ce réactif peut être utilisé immédiatement et élimine donc les préoccupations concernant la qualité de vecteur et de l’intégrité. En outre, ce réactif ne nécessite pas l’utilisation des traitements potentiellement dangereux ou des lipides et des produits chimiques de colorant-chargement. À la différence des étiquettes fluorescentes conventionnelles, le régent de CL-HB taches indépendamment de fonction (i.e., potentiel membranaire). Le régent de CL-HB peut être simplement ajouté aux cellules et incubé durant une nuit à l’expression de la protéine. Le régent de CL-HB ne se réplique pas dans les cellules de mammifères et sont utilisables dans les paramètres de niveau 1 laboratoire (BSL) de prévention des risques biotechnologiques. Aussi, cette transfection transitoire peut être détectée après une nuit d’incubation jusqu'à 5 jours, suffisamment de temps pour procéder à des analyses cellulaires plus dynamiques.
Par ailleurs, les anomalies chromosomiques pourraient être étudiées par différentes techniques telles que la cytométrie en flux, immunohistochimie ou fluorescence in situ hybridation (poisson) 6. Cytométrie en flux peut être utilisée pour étudier l’aneuploïdie, qui peut être mesurée basée sur le contenu en ADN et la phase de cellules dans le cycle cellulaire. Bien que la cytométrie en flux peut être utilisée pour mesurer l’aneuploïdie, il ne fournit pas les informations sur la ségrégation chromosomique mauvaise. Techniques de poisson et l’immunohistochimie utilisent des sondes fluorescentes pour lier à l’ADN ou des chromosomes. Bien que ces techniques fournissent un instantané de l’état d’une population de cellules, ils ne permettent pas de cellules vivantes d’imagerie manquant ainsi toute information obtenue par le biais de visualisation spatio-temporelle de la cytokinèse dans certaines cellules suivies sur une période de temps.
Ce protocole a été utilisé pour étudier les chromosomes retardataires ou chromosomique mauvaise ségrégation dans la nocodazole traité fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) isolés de PP2A-B56γ-souris. Ce protocole prévoit, en plus de demande, un outil simple pour étiqueter et visualiser la ségrégation chromosomique dans divers types de cellules qui permet d’étudier la régulation du cycle cellulaire ou une instabilité chromosomique dans les cellules tumorales. En outre, il peut également être utilisé pour étudier l’instabilité chromosomique causée par différents traitements médicamenteux ou à étudier les effets du gène assommer résultant de la mis ségrégation chromosomique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:128px;">11320082</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">MEM Non-Essential amino acids solution (100X)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered saline</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:135px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>MX 1458-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryogenic vial storage boxes</td>
			<td style="width:135px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">10-500-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Cryogenic vials</td>
			<td style="width:135px;">Corning/costar</td>
			<td align="right">431416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:135px;">Cellstar</td>
			<td align="right" style="width:128px;">658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">2 well chambered cover glass</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td style="width:128px;">155380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cellometer Vision Cell Profiler</td>
			<td style="width:135px;">Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td style="width:128px;">Cellometer Vision Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:128px;">C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system</td>
			<td style="width:135px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td style="width:128px;">Zeiss Cell Observer SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Water Bath</td>
			<td style="width:135px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:128px;">280 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Incubator</td>
			<td style="width:135px;">Sanyo commercial solutions</td>
			<td style="width:128px;">MCO-18AIC (UV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Class II Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:135px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:128px;">SterilGard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Axiovision software</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:128px;">Ver.4.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:135px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:128px;">Ver. 1.51r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of chromosome segregation during mitosis

Chromosomes doivent être fiable et uniforme divisés en cellules filles pendant la division cellulaire mitotique. Fidélité de la ségrégation chromosomique est contrôlée par les mécanismes multiples qui incluent le Checkpoint de montage broche (SAC). Le SAC fait partie d’un système de rétroaction complexe qui est responsable de la prévention d’un progrès de cellulaire par mitose, à moins que tous les kinétochores chromosomiques ont joint à la broche de microtubules. Calorifugeage chromosomique et chromosome anormal est un indicateur des postes de contrôle dysfonctionnel cycle cellulaire de la ségrégation et peut être utilisée pour mesurer la stabilité génomique des cellules en division. Déréglementation du SAC peut entraîner la transformation d’une cellule normale en une cellule maligne à travers l’accumulation des erreurs au cours de la ségrégation chromosomique. Mise en œuvre du SAC et la formation du kinétochore complexe sont étroitement contrôlée par les interactions entre les kinases et phosphatases tels que de la protéine Phosphatase 2 a (PP2A). Ce protocole décrit l’imagerie de cellules vivantes des chromosomes dans les fibroblastes embryonnaires de souris isolés de souris qui avaient un masquage de la sous-unité régulatrice PP2A-B56γ à la traîne. Cette méthode permet de surmonter les défauts des autres cell cycle control techniques d’imagerie comme cytométrie ou immunocytochimie seulement présentent un portrait de cellulaire cytocinèse, au lieu d’une visualisation dynamique spatio-temporelle des chromosomes au cours de la mitose.

MEFs de type sauvage et PP2A-B56γ-souris ont été ensemencées dans une chambre de 2 puits couvercle en verre et autorisés à fixer. Jour 2, MEFs ont été synchronisées à l’aide de 0,1 % FBS pendant 24 h. Jour 3, MEFs dans les médias, avec 200 ng/mL nocodazole et 30 CL de PPC-HB regentwere incubés pendant 18 h à 37° C et 5 % CO2. Jour 4, les cellules ont été projetés en utilisant un système de microscope confocal de disque de rotation (<strong class="...

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Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Ce protocole décrit une méthode simple et pratique pour étiqueter et visualiser direct chromosomes dans les cellules mitotiques en utilisant l’étiquette Histone2B-GFP BacMam 2.0 et un système de microscopie confocale tourne disque.

Imagerie de cellules vivantes de la ségrégation des chromosomes pendant la mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

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