カンジダ・アルビカンスのバイオフィルムは、多くの生物学的標本と同様に、その原生の状態では不透明に重く半透明である。これらのプロトコルでは、明確化法を用いて、固定インタクトバイオフィルムの内部構造を光学断面顕微鏡で画像化できることを示す。簡単で安価で比較的高速な処理工程により、コンフォーカル走査蛍光顕微鏡法により、固定インタクトバイオフィルムを3Dイメージング用に透明にすることができます。
今日この手順を実証することは、ケイティ・Lagree、ここで博士研究員、そして私になります。12ウェルプレートでバイオフィルムの成長を開始するには、テキストプロトコルに記載されているようにプレートを準備します。加湿した37°Cの空気インキュベーターに60 RPM軌道ミキサーにプレートを90分間置き、細胞接着の時間を割きます。
90分後、培地と未接続の細胞を取り除き、滅菌培地またはPBSで洗浄します。接種したスストラタを、あらかじめ温めたフィラメンテーション媒体を含む別のマルチウェルプレートに移します。プレートを37°C加湿周囲空気インキュベーターに戻し、60 RPMの軌道混合でバイオフィルムを48時間まで成長させて通気します。
インキュベーターから48時間プレートを取り出し、各標本から培養液を取り出します。培地をPBSに置き換え、数分間インキュベートして血清タンパク質を希釈します。PBSを取り除いた後、ウェルに固定剤を補充します。
十分な固定容積は、皿の内側の側面に任意を含むすべてのバイオフィルムの成長を浸すために各皿に加えられるべきである。覆われた皿をゆっくりとした軌道ミキサーに20分間セットします。テキストプロトコルに記載されているように固定液を除去した後、PBSを排出し、PBSと必要な汚れを含む溶液で素早く井戸を補充して染色の準備をします。
バイオフィルムを数秒以上水切りまたは乾燥させないでください。皿に汚れを加えます。必要な汚れの量は、バイオフィルム質量に依存します。
その後、一晩遅い軌道ミキサーに覆われた皿を設定し、箔や黒い紙で光から保護します。ピンセットを使用して、固定染色されたバイオフィルムをPBSから50/50 PBSメタノールの5ミリリットルに移し、バイオフィルムを上に向けた20ミリリットルガラスバイアルに入れます。手動で軌道運動と1分間隔で5分間混ぜます。
ピペットとバイオフィルムまたはバイオフィルムとバイアルとの接触を避けるために慎重である廃棄物ボトルに溶媒を除去します。きちんとしたメタノールの3ミリリットルをそっと補充します。手動で軌道運動と1分間隔で3分間混合します。
今、廃棄物ボトルに溶媒を除去し、すぐにメタノールの5ミリリットルで補充します。手動で軌道運動と1分間隔で5〜10分間混合した後、廃ボトルに溶媒を除去する。すぐに3ミリリットルのメタノールを補充する。
バイオフィルムは、この時点で最初の外観よりも不透明に見えることがよくあります。廃ボトルに溶剤を取り出し、すぐに50/50メタノールメチルサリチル酸の5ミリリットルでバイアルを補充します。手動で軌道運動と1分間隔で5~10分間混ぜ合わせます。
バイオフィルムは、この混合溶媒中で半透明でなければなりません.廃ボトルに溶剤を除去した後、きちんとしたメチルサリチル酸の3ミリリットルでバイアルを静かに補充します。手動で軌道運動と1分間隔で3分間混合します。
5ミリリットルのきちんとしたメチルサリチル酸塩で再びプロセスを繰り返し、5〜10分間1分間隔で手動で混合します。この時点で、バイオフィルムは透明でなければなりません。廃ボトルに溶剤を取り除き、すぐにきちんとしたメチルサリチル酸の3ミリリットルでバイアルを補充します。
処理されたバイオフィルムは、この溶媒において安定である。逆顕微鏡を使用する場合は、カバーグラス底部を備えた防溶剤皿を使用し、逆の標本の支持のためにスペーサーを準備してください。ここで、スペーサーは、膨潤による焦点ドリフトを最小限に抑えるために1時間、メチルサリチル酸に予め浸された13ミリメートルのシリコーンリングである。
医療グレードのシリコーンスクエアのバイオフィルムの場合は、正方形を反転し、皿の中のメチルサリチル酸塩のプール内のスペーサーに設定します。標本の下の泡を避けるようにしてください。皿を顕微鏡のステージにしっかりと取り付け、油を浸して目的に合わせます。
半月板が表面張力によってスペーサーの上にしっかりと試料を保持するように、皿の中のメチルサリチル酸塩の量を調整します。逆角の下層部の上に、メチルサリチル酸の液滴を置き、マット仕上げからの光の散乱を減らします。その後、蒸発を制限するためにガラス板で皿を覆います。
イメージングの前に、試料がスペーサーに落ち着くのに数分待ちます。ここで、テキストプロトコルに記載されているように、共焦点顕微鏡を実行して標本を画像化します。画像を処理するには、ImageJ またはフィジーを開きます。
プログラムに、処理するデータに十分なメモリが割り当てられていることを確認します。2 ギガバイトのデータセットを処理するには、操作を円滑にするために少なくとも 8 GB の専用 RAM が必要です。処理するシリアル プレーン イメージ ファイルを開きます。
コンピュータにスタック全体を処理するのに十分な RAM がない場合は、サブスタックを処理してから、1 つのスタックに再構成できます。イメージ メニュー、タイプ、32 ビットを使用して浮動小数点算術演算を有効にするには、データを 32 ビット形式に変換します。これにより、ファイル サイズが 2 倍になります。
スムーズな背景を引き、フォーカス中のフィーチャのコントラストを高くします。プロセスメニューにナビゲートして、バックグラウンドを減算して、スタック全体を処理します。必要に応じて、ローリングボールの半径を調整します。
ボール半径は、保持するフォーカス内フィーチャの最大寸法よりも大幅に大きくする必要があります。負のピクセルをすべてゼロに設定するには、各画像を絶対値に追加します。まず、イメージメニュー、複製、重複スタックを使用してスタックを複製します。
次に、プロセスメニュー、数学、絶対値を使用して、重複したデータの絶対値を取ります。プロセスメニュー、画像計算機、追加にナビゲートすることによって、2つのスタックを追加します。イメージスタックを軸に再スライスするには、イメージメニュー、スタック、再スライスを使用します。
次に、出力間隔 1.0 を選択し、先頭から始め、補間を避けます。フォーカス軸がスタック内の垂直軸になりました。再スライスされたスタックの Y 次元は、フォーカス平面の数と等しくなります。
スタックの一部または全部をサイドビュー投影にするには、イメージメニュー、スタック、Z プロジェクトに移動します。開始スライスと停止スライスを設定して、側面ビューの一部またはすべてを含めます。最良の結果を得るには、最大強度を選択します。
イメージメニュー、スケールにナビゲートして、サイドビュー投影の軸方向のスケーリングを修正します。この投影は、軸方向の尺度係数を使用して、等しくないイメージ プレーンのピクセル化とフォーカス増分を修正する必要があります。X スケールを 1 に設定し、Y スケールを軸尺度係数に設定します。
バイキュービック補間を選択します。[新しいウィンドウの作成] を選択します。明るさとコントラストを調整します。
その後、表示用に 8 ビット形式に変換します。または、色参照テーブルを適用し、RGB または 8 ビットカラーで保存します。屈折率の上昇の連続的に混和性の溶媒を使用して、明瞭さの最大値を迅速に推定することができる。
これは、最小コントラストのポイントを見つけるために、従来の位相コントラスト顕微鏡によって精製されています。1つのバイオフィルムは、キシレンとその範囲の狭い基準液体セットとの間で連続的に交換された。交換のたびに、同じフィールドが再配置され、カバーグラスを通して見られました。
増加指数では、コントラスト反転は、nが細胞壁の1.530に等しいときに最初に見られ、次いでnが1.535に等しいときに細胞質が続きます。変異型および野生型C.albicansバイオフィルムの深いイメージングをここに示す。野生型バイオフィルムは、538平面共焦点画像スタックの側面図投影に見られるように、502ミクロンの厚さに成長しました。
頂点から基底までの軸方向の突起は、バイオフィルムの細胞タイプおよび異なる層の変動を示す。この例は、特徴的な野生型構造を示しています。変異型バイオフィルムは、556平面画像スタックの側面図投影に見られるように、500ミクロンの厚さに成長した。
ストレッサーを誘導しない場合に糸状成長を起こすることが知られているこの変異体は、劇的に異なるアーキテクチャを生み出した。側面図と軸方向の両方の突起に見られるように、多くの分岐細胞は放射状の成長を生じさせる。これは高屈折率深いイメージングプロトコルです。
理想的には、試料の屈折率と浸漬油の屈折率が一致する必要があります。そのため、この場合、油浸しの目的を使用します。我々の研究のほとんどは、細胞壁マーカーを用いたバイオフィルムの構造イメージングであったが、固定標本で使用される蛍光法は、免疫蛍光、その際の蛍光のハイブリダイゼーション、レポーター遺伝子発現などで働くべきである。
この特定の生物、カンディダ・アルビカンスは、健康な人間の間でのコメンタルであるが、また、粘膜または全身酵母感染症を引き起こす可能性のある日和見病原体である。いくつかの機関では、BSL IIの封じ込め方法とプロトコルが必要です。さらに、ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド固定剤は揮発性で危険です。
彼らは発がん性物質として知られています。ヒュームフードに固定液の希釈液を作ります。希釈した固定液を含む食器を覆い、これらの固定剤を含む容器をバイオセーフティキャビネットまたは細胞培養インキュベーターに入れないでください。
