Questo protocollo consente di affettare i semi intatti in modo che non si sbriciolino, consentendo la visualizzazione di granuli di amido in qualsiasi seme che possa adattarsi alla punta di una pipetta. Il cono di plastica malleabile supporta la struttura nativa dei tessuti e degli organi secchi, quindi questo collettore economico e facile consente di elaborare molti campioni in breve tempo. Per andare avanti dal vantaggio della microscopia forense qui, amido resistente, qualcosa che stiamo tutti cercando, accessibilità degli enzimi a quell'amido grezzo, amilolisi, indice glicemico e picchi di glucosio, questi sono parametri fondamentali per allevare migliori varietà di riso per combattere il diabete di tipo 2 in tutto il mondo oggi.
E ora è un grande piacere presentarvi il Dr.Kiah Barton. La dott.ssa Barton proviene dal nostro laboratorio e utilizzerà la struttura di imaging di base della facoltà per mostrarti come viene implementata questa tecnica. Inizia con la sbucciatura dei chicchi secchi.
Posizionare un singolo kernel su un tappo di gomma piatto su un banco di lavoro e assicurarsi che questo tappo rimanga fermo. Utilizzare un secondo tappo di gomma piatto per abradere il nocciolo torcendolo contro il primo tappo di gomma, quindi rimuovere le bucce dal nocciolo, facendo attenzione a non frantumare l'endospermando i semi in modo troppo aggressivo tra i due bungs di gomma. Rimuovere le bucce rimanenti con una pinza fine e inserire un singolo chicco decorticato in una punta di pipetta di plastica da 250 microlitri.
Assicurarsi che l'estremità embrionale del kernel sia rivolta verso l'estremità conica della punta della pipetta. Inserire una seconda punta di pipetta da 250 microlitri per forzare il kernel nella prima punta della pipetta e per mantenere il kernel immobile durante il sezionamento, facendo attenzione a non danneggiare il kernel o piegare la seconda punta della pipetta. Appoggiare l'assemblaggio della punta della pipetta su un banco da lavoro e tenerlo in posizione a mano.
Con l'altra mano, usa una lama affilata per bisturi per tagliare il centro del nocciolo, tagliando l'estremità della punta della pipetta. Tagliare verso il basso attraverso l'assemblaggio e quindi orientare verticalmente la lama del bisturi in modo che le due nuove facce esposte della sezione della mano siano parallele. Quindi utilizzare il bisturi per tagliare sezioni spesse un millimetro del chicco di riso.
Per eseguire la microscopia a luce riflessa, posizionare le sezioni trasversali di riso su un pezzo di carta nera pesante. Ottenere immagini luminose delle sezioni trasversali utilizzando uno stereomicroscopio con colli d'oca montati per l'illuminazione obliqua, utilizzando almeno 10 volte l'ingrandimento. Le sezioni Nipponbare e ssg1 di tipo selvaggio sono state esaminate sotto ingrandimenti 260 volte, 920 volte e 4.200 volte.
Se adeguatamente preparate, le sezioni di riso avevano uno spessore di circa 0,9 millimetri con una minima frantumazione dell'endosperma e strati intatti di pericarpo e aleurone. Questa tecnica consente la preparazione di sezioni di qualità sufficiente per osservare l'intera cellula dell'endosperma, i granuli di amido composti e i singoli sottogranuli. I produttori di kernel traslucido, come la linea ibrida di amido resistente al wild-type, Zhehui 7954 e il mutante RS111 generato dal cobalto, hanno prodotto granuli di amido poliedrico strettamente imballati, che è il normale fenotipo dell'endosperma del riso.
Le immagini SEM dei produttori di kernel gessosi, varietà commerciali Ye Tang e RS4, mostravano granuli di amido rotondi e confezionati in modo approssimativo. Il selvaggio Xiushiu 11 e il suo mutante KMD1, che esprimeva il gene Cry1Ab per inibire la predazione degli insetti, avevano sezioni e morfotipi di endosperma simili alle linee di amido resistenti traslucide. Questa tecnica può essere applicata a semi di altre specie.
Il modello monocotiledone, Brachypodium distachyon, produce semi molto duri, ma era comunque possibile ottenere una sezione trasversale intatta. Anche le sezioni trasversali intatte sono state prodotte da grano invernale morbido e bianco. Questo metodo di screening rapido ed economico per guardare all'interno di strutture biologiche può essere applicato a zampe di insetti, punte di alberi di locus bean, biancospini, spine di pesci o qualsiasi campo di microscopia forense che possa trarre profitto da questa configurazione di supporto del campione.
Dopo aver eseguito questo protocollo, il rivestimento sputter per elettromicroscopia, la colorazione con coloranti fluorescenti specifici e l'applicazione di calcafluor per colorare per uno spessore della parete delle cellule beta glucano in linee mutanti di avena e orzo sono alcuni modi rapidi per avvicinarsi all'allevamento vegetale con uno screening rapido del fenotipo.
