Este projeto foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde R21 NS104801 (EMB) e R01 NS115994 (LBW/EB) e Pelo Prêmio Focado na Saúde Infantil de Atlanta Junior Faculty Focused (EMB). Este trabalho também foi apoiado pelo Departamento de Defesa dos EUA através dos Programas de Pesquisa Médica Dirigidos pelo Congresso sob o Prêmio Nº. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são do autor e não são necessariamente endossadas pelo Departamento de Defesa. Este material é baseado em trabalho apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação em Pesquisa da Fundação Nacional de Ciência sob o grant no. 1937971. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência.

Todos os procedimentos animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais da Universidade Emory (IACUC) e seguiram as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Modelo de queda de peso de lesão cerebral traumática leve
<ol><li>Prepare a configuração de queda de peso. Monte uma víse sobre uma superfície plana com um tubo-guia de 1 m (2,54 cm de diâmetro interno) alinhado verticalmente (verifique usando um nível). Use um parafuso ...

<ol>
	<li>Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+impact+of+traumatic+brain+injury:+a+brief+overview.">The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview.</a> Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).</li><li>Iraji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+State+Functional+Connectivity+in+Mild+Traumatic+Brain+Injury+at+the+Acute+Stage:+Independent+Component+and+Seed-Based+Analyses.">Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).</li><li>Guskiewicz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cumulative+effects+associated+with+recurrent+concussion+in+collegiate+football+players:+the+NCAA+Concussion+Study.">Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study.</a> Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).</li><li>Longhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+window+of+vulnerability+to+repetitive+experimental+concussive+brain+injury.">Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury.</a> Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).</li><li>Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , (2014).</li><li>Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+Pathophysiology+of+Concussive+Brain+Injury+-+an+Update.">The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update.</a> Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).</li><li>McCrory, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+statement+on+concussion+in+sport--the+4th+International+Conference+on+Concussion+in+Sport+held+in+Zurich,+November+2012.">Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012.</a> Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).</li><li>Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+neuroimaging+techniques+in+mild+traumatic+brain+injury.">Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury.</a> Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).</li><li>Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+in+Resting+State+Functional+Connectivity+and+Cerebral+Blood+Flow+in+Mild+Traumatic+Brain+Injury+Patients.">Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients.</a> PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).</li><li>Buckley, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+Microvascular+Cerebral+Blood+Flow+Assessed+by+Diffuse+Correlation+Spectroscopy+after+Repetitive+Concussions+in+Mice.">Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).</li><li>Sankar, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cerebral+blood+flow+is+a+non-invasive+biomarker+of+neuroinflammation+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury.">Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury.</a> Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).</li><li>Vagnozzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+window+of+metabolic+brain+vulnerability+to+concussions:+mitochondrial-related+impairment--part+I.">Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I.</a> Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).</li><li>Longhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+window+of+vulnerability+to+repetitive+experimental+concussive+brain+injury.">Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury.</a> Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).</li><li>Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensity-+and+interval-specific+repetitive+traumatic+brain+injury+can+evoke+both+axonal+and+microvascular+damage.">Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage.</a> Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).</li><li>Angoa-Perez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sports-related+head+injury:+bridging+the+gap+between+preclinical+research+and+clinical+reality.">Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality.</a> Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).</li><li>Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+human+repetitive+mild+traumatic+brain+injury.">A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).</li><li>Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Recovery+Time+Between+Injuries+Improves+Cognitive+Outcome+After+Repetitive+Mild+Concussive+Brain+Injuries+in+Mice.">Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice.</a> Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).</li><li>Durduran, T., Yodh, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+correlation+spectroscopy+for+non-invasive,+micro-vascular+cerebral+blood+flow+measurement.">Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement.</a> NeuroImage. 85, 51-63 (2014).</li><li>Sathialingam, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+separation+diffuse+correlation+spectroscopy+for+measurement+of+cerebral+blood+flow+in+rodents.">Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents.</a> Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).</li><li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+assessment+of+resting-state+cerebral+blood+flow+in+children+with+sickle+cell+disease.">Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease.</a> Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).</li><li>Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+partial+least-squares+regression+models+with+VARIMAX+rotation.">Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation.</a> Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).</li><li>Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-+and+Megavariate+Data+Analysis+Basic+Principles+and+Applications.">Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications.</a> Umetrics Academy. , (2013).</li><li>Conzen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+and+regional+hemodynamics+of+isoflurane+and+sevoflurane+in+rats.">Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats.</a> Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).</li><li>Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+optics+for+tissue+monitoring+and+tomography.">Diffuse optics for tissue monitoring and tomography.</a> Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).</li><li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+separation+frequency-domain+near-infrared+spectroscopy+for+the+recovery+of+tissue+optical+properties+at+millimeter+depths.">Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths.</a> Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).</li><li>. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models Available from: <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm">https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm</a> (2019)</li><li>White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+functional+connectivity+in+the+mouse+brain.">Imaging of functional connectivity in the mouse brain.</a> PLoS One. 6, 16322 (2011).</li><li>Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+correlation+spectroscopy+for+measurement+of+cerebral+blood+flow:+future+prospects.">Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects.</a> Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).</li><li>Rowan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+reactivity+measured+in+awake+mice+using+diffuse+correlation+spectroscopy.">Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy.</a> Neurophotonics. 8 (1), (2021).</li><li>Tate, J., Ward, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferences+in+immunoassay.">Interferences in immunoassay.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).</li><li>Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+quantification+of+cytokines+present+at+low+concentrations+in+small+human+mucosal+tissue+samples+using+Luminex+assays.">Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays.</a> Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).</li><li>Gierut, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network-level+effects+of+kinase+inhibitors+modulate+TNF-&#945;-induced+apoptosis+in+the+intestinal+epithelium.">Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-&#945;-induced apoptosis in the intestinal epithelium.</a> Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).</li></ol>

Aqui detalhamos métodos para avaliação da resposta hemodinâmica e neuroinflamatória à lesão cerebral traumática leve repetitiva. Além disso, mostramos como integrar esses dados como parte de uma análise de sistemas multivariados usando regressão parcial de quadrados. No texto abaixo discutiremos algumas das principais etapas e limitações associadas ao protocolo, bem como as vantagens/desvantagens dos métodos sobre os métodos existentes.
Modelo de queda de peso de lesão ...

Visão geral Lesões cerebrais traumáticas leves (mTBIs) impactam ~1,6-3,8 milhões de atletas anualmente1. Essas lesões, incluindo lesões sub-concussivas e concussivas, podem deixar os pacientes com sintomas físicos, emocionais, psicológicos e cognitivos transitórios2. Além disso, o mTBI repetitivo (rmTBI) sustentado dentro de uma "janela de vulnerabilidade" pode levar à gravidade cumulativa e duração de consequências cognitivas que duram mais do que os efeitos de um único mTBIsozinho 3, e, em última instância, até mesmo para perda permanente da função 4,5,6. Embora muitos pacientes se recuperem em um período relativamente curto (<1 semana), 10-40% dos pacientes sofrem efeitos mais duradouros do MTBI por > 1 mês, com alguns durando até 1 ano 3,7,8,9. Apesar da alta prevalência e das consequências duradouras dessas lesões, os mecanismos de lesão são mal compreendidos e não existem estratégias eficazes de tratamento.
Dada a alta variabilidade nos resultados após o mTBI/rmTBI, um desafio na identificação de gatilhos moleculares em estágio inicial a partir de tecidos obtidos em estudos terminais de mTBI/rmTBI é a falta de dados longitudinais demonstrando "ligações moleculares agudas" definitivas desses gatilhos moleculares para desfechos de longo prazo. Para superar esse desafio, nosso grupo descobriu que o fluxo sanguíneo cerebral reduzido agudamente medido agudamente usando uma ferramenta óptica chamada espectroscopia de correlação difusa (DCS), correlaciona fortemente com o desfecho cognitivo de longo prazo em um modelo de camundongo de rmTBI10. Usando este biomarcador hemodinâmico, mostramos que camundongos com fluxo sanguíneo cerebral agudamente baixo (e, por extensão, pior resultado previsto a longo prazo) têm aumentos agudos concomitantes na sinalização de fosfo neuronal dentro das vias MAPK e NFκB, aumentos na expressão neuronal de citocinas pró-inflamatórias e aumentos na expressão do marcador de fagocite/microglialIba111 . Esses dados sugerem um possível papel para a sinalização neuronal, expressão citocina e ativação microglial tanto na regulação aguda do fluxo sanguíneo cerebral pós lesão como no desencadeamento de uma cascata de sinalização que leva a disfunção neuronal e pior desfecho cognitivo. Aqui, detalhamos nossa abordagem para sondar simultaneamente o ambiente hemodinâmico e neuroinflamatório após o RMTBI e como integrar esses complexos conjuntos de dados. Especificamente, delineamos procedimentos para quatro passos-chave para esta abordagem abrangente: (1) um modelo de queda de peso de lesão cerebral traumática leve, (2) avaliação do fluxo sanguíneo cerebral com espectroscopia de correlação difusa, (3) quantificação do ambiente neuroinflamatório e (4) integração de dados (Figura 1). Abaixo, fornecemos uma breve introdução a cada um desses passos-chave para ajudar a orientar os leitores através da lógica por trás de nossos métodos. O restante do manuscrito fornece um protocolo detalhado para cada uma dessas etapas-chave.
Modelo de queda de peso de lesão cerebral traumática leve Embora muitos excelentes modelos pré-clínicos de TCE leve repetitivo existam 12,13,14,15,16,17,18, empregamos um modelo de lesão de cabeça fechada bem estabelecido e clinicamente relevante. As principais características deste modelo incluem (1) impacto contundente do crânio/couro cabeludo intacto seguido de rotação irrestrita da cabeça sobre o pescoço, (2) nenhuma lesão cerebral estrutural aberta, edema, dano de barreira hematoencefálica, morte celular aguda ou perda crônica do tecido cerebral, e (3) déficits cognitivos persistentes (até 1 ano) que surgem somente após múltiplos acertos19 (Figura 2).
Avaliação do fluxo sanguíneo cerebral com espectroscopia de correlação difusa Espectroscopia de correlação difusa (DCS) é uma técnica óptica não invasiva que mede o fluxo sanguíneo 5,20,21. Em DCS, uma fonte de luz quase infravermelha é colocada na superfície do tecido. Um detector é colocado a uma distância fixa da fonte na superfície do tecido para detectar a luz que se multiplica espalhada pelo tecido (Figura 3). A dispersão dos glóbulos vermelhos em movimento faz com que a intensidade da luz detectada flutue com o tempo. Um modelo analítico simples conhecido como teoria da difusão de correlação é usado para relacionar essas flutuações de intensidade a um índice de fluxo sanguíneo (CBFi, Figura 4). Embora as unidades da CBFi (cm2/s) não sejam as unidades tradicionais de fluxo (mL/min/100 g), estudo prévio em camundongos mostrou quea CBF se correlaciona fortemente com o fluxo sanguíneo cerebral medido pela ressonância magnética arterial rotulada21.
Para referência, o instrumento DCS utilizado aqui foi construído internamente e é composto por um laser de coerência de 852 nm de comprimento de coerência, uma matriz de 4 fótons contando fotodiodos avalanche, e uma placa de autocorrelador de hardware (tau único, 8 canais, tempo mínimo de amostra de 100 ns)21,22. Os dados são adquiridos com software caseiro escrito no LabView. A interface animal para o dispositivo consiste em uma fibra de origem multimoda de 400 μm (400-2200 nm de comprimento de onda, núcleo de sílica pura, tecs hard cladding) e um detector de modo único de 780 nm (780-970 nm de comprimento de onda, núcleo de sílica pura, tecs hard cladding, 730 ± 30 nm segundo modo de corte) espaçado 6 mm de distância e embutido em um sensor preto impresso em 3D (4 mm x 8 mm, Figura 3).
Quantificação do ambiente neuroinflamatório Embora a neuroinflamação seja regulada por diversos processos celulares, dois mecanismos relevantes principais são a sinalização extracelular por citocinas/quimiocinas e sinalização intracelular por fosfo-proteínas. Para investigar o ambiente neuroinflamatório do cérebro pós-lesão, os cérebros são extraídos de camundongos, microdissectados, e citocinas/quimiocinas e fosfo-proteínas são quantificadas usando Luminex (Figura 5, Figura 6, Figura 7). Os imunoassedos multiplexados Luminex permitem quantificação simultânea de uma coleção diversificada dessas proteínas, acoplando ensaios imunosorentes ligados a enzimas (ELISAs) a contas magnéticas marcadas fluorescentemente. Etiquetas fluorescentes distintas são usadas para cada proteína de interesse, e contas de cada tag são funcionalizadas com um anticorpo de captura contra essa proteína em particular. Centenas de contas para capturar cada proteína são misturadas, colocadas em uma placa de 96 poços, e incubadas com amostra. Após a incubação da amostra, um ímã é usado para prender as contas no poço enquanto a amostra é lavada. Em seguida, o anticorpo de detecção biotiningada liga-se ao analito de interesse para formar um sanduíche de anticorpo-antígeno semelhante a um ELISA tradicional, mas com o ELISA para cada proteína ocorrendo em uma conta fluorescente diferente marcada fluorescente. Adicionar streptavidina conjugado por ficoerythrin (SAPE) completa cada reação. O instrumento Luminex então lê as contas e separa o sinal de acordo com cada tag/proteína fluorescente.
Integração de dados Devido ao grande número de analitos (por exemplo, citocinas) medidos no ensaio luminex, a análise de dados pode ser difícil de interpretar se cada proteína quantificada for analisada individualmente. Para simplificar a análise e capturar tendências observadas entre os analitos, utilizamos um método de análise multivariada chamado regressão parcial de quadrados (PLSR, Figura 8)23. A PLSR funciona identificando um eixo de pesos correspondente a cada proteína medida (ou seja, citocinas ou fosforas, referidas como "variáveis preditoras") que, juntas, explicam a covariância das proteínas medidas com uma variável de resposta (por exemplo, fluxo sanguíneo cerebral). Os pesos são chamados de "carregamentos" e são montados em um vetor conhecido como uma variável latente (LV). Ao projetar (chamados de "pontuação") os dados de proteína medidos em cada um dos dois LVs, os dados podem ser re-plotados em termos desses LVs. Após a computação do PLSR, usamos uma rotação varimax para identificar um novo LV que maximiza a covariância entre as projeções amostrais na LV e a variávelpreditor 24. Essa abordagem nos permite definir o LV1 como o eixo para o qual a variância da variável de resposta é melhor explicada. O LV2 maximiza a covariância entre a variável de resposta e os dados residuais LV1, que podem estar associados à variabilidade biológica ou técnica entre as amostras. Por fim, realizamos uma Validação De Uma Saída fora de Ristração (LOOCV) para garantir que o modelo PLSR não dependa fortemente de nenhuma amostra23.
Neste protocolo, detalhamos métodos para caracterizar a resposta neuroinflammatória e hemodinâmica ao mTBI. O fluxo de trabalho geral está descrito na Figura 1. Neste protocolo, os camundongos estão sujeitos a um ou mais mTBIs usando um modelo de lesão na cabeça fechada com queda de peso. O fluxo sanguíneo cerebral é medido longitudinalmente antes e em vários pontos de tempo após a lesão. No momento de interesse para interrogatório de alterações neuroinflamatórias, o animal é eutanizado, e o cérebro é extraído. As regiões de interesse cerebrais são isoladas por microdisseção e, em seguida, lístidas para extrair proteína. Os lysatos são então usados tanto para imunoensatos multiplexados Luminex de citocina e expressão fosfo-proteína, bem como para a mancha ocidental. Finalmente, este conjunto de dados holístico é integrado usando uma análise parcial de regressão de quadrados.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adjustable pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any adjustable pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex cell lysis kit</td>
			<td>C Bio-Rad</td>
			<td>171304012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile</td>
			<td>BrandTech</td>
			<td>781602 96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini protease inhibitor tablet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiH2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRL0200-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates</td>
			<td>Millipore Sigma Catalogue</td>
			<td>40-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware Autocorrelator Board</td>
			<td>www.correlator.com</td>
			<td>Flex05-8ch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 250 mL</td>
			<td>MED-VET INTERNATIONAL</td>
			<td>RXISO-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe (11.2 x 21.3 cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Drive Fluid</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>MPXDF-4PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex sheath fluid</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SHEATHFLUID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MCYTMAG-70K-PX32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>48-660MAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini LabRoller rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Sealer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microfuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20901-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini LabRoller</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z674591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Programming Language</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>www.rstudio.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titer plate shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 m acrylic guide tube</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>49035K85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 photon counting avalanche photodiode</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>SPCM-AQ4C-IO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 um multimode source fiber</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>FT-400-EMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54 g bolt</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td></td>
			<td>0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>780 nm single mode detector fiber</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>780HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>852 nm long-coherence length laser</td>
			<td>TOPTICA Photonics</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systems analysis of the neuroinflammatory and hemodynamic response to traumatic brain injury

Lesões cerebrais traumáticas leves (mTBIs) são um problema significativo de saúde pública. A exposição repetida ao mTBI pode levar a déficits funcionais cumulativos e duradouros. Inúmeros estudos do nosso grupo e outros mostraram que o mTBI estimula a expressão da citocina e ativa a microglia, diminui o fluxo sanguíneo cerebral e o metabolismo, e prejudica a reatividade cerebrovascular. Além disso, vários trabalhos têm relatado associação entre desarranjos nesses marcadores neuroinflammatórios e hemodinâmicos e prejuízos cognitivos. Aqui detalhamos métodos para caracterizar a resposta neuroinflammatória e hemodinâmica ao mTBI em camundongos. Especificamente, descrevemos como executar um modelo de queda de peso de mTBI, como medir longitudinalmente o fluxo sanguíneo cerebral usando uma técnica óptica não invasiva chamada espectroscopia de correlação difusa, e como realizar um imunoensaio multiplexado Luminex em amostras de tecido cerebral para quantificar citocinas e proteínas mifosias imunomodulatórias (por exemplo, dentro das vias MAPK e NFκB) que respondem e regulam a atividade de microglia e outras células imunes neurais. Por fim, detalhamos como integrar esses dados utilizando uma abordagem de análise de sistemas multivariados para entender as relações entre todas essas variáveis. Compreender as relações entre essas variáveis fisiológicas e moleculares nos permitirá, em última análise, identificar mecanismos responsáveis pelo MTBI.

Os dados coletados anteriormente foram extraídos de trabalhos anteriores em que um grupo de oito camundongos C57BL/6 foram submetidos a três lesões na cabeça fechada (Figura 2) espaçadas uma vez por dia11. Neste trabalho, o fluxo sanguíneo cerebral foi medido com espectroscopia de correlação difusa 4h após a última lesão (Figura 3, Figura 4). Após avaliação pós-lesão da CBF, os animais foram e...

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Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury

Este protocolo apresenta métodos para caracterizar a resposta neuroinflammatória e hemodinâmica à lesão cerebral traumática leve e integrar esses dados como parte de uma análise de sistemas multivariados utilizando regressão parcial de quadrados.

Análise de Sistemas da Resposta Neuroinflammatória e Hemodinâmica à Lesão Cerebral Traumática

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional ...

Esses métodos podem ser usados para caracterizar respostas neuroinflamatórias e hemodinâmicas à lesão cerebral como parte de uma análise do sistema multivariado usando regressão parcial de quadrados. Essas técnicas são usadas para dar uma visão mais holística da resposta do cérebro à lesão. Para induzir uma lesão, confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do pé em um rato anestesiado e coloque o rato na posição propensa no centro de uma membrana fina.Usando ambas as mãos para segurar o tecido ensinado, fixar a cauda do rato sob um polegar e posicionar-se para a cabeça do mouse sob o tubo guia. Quando o mouse estiver em posição, visando o impacto entre a parte de trás dos olhos e a frente das orelhas, solte o parafuso do topo do tubo guia sobre o aspecto dorsal da cabeça do mouse. Com o impacto, o rato romperá o tecido, permitindo uma aceleração rápida da cabeça sobre o pescoço.Após a lesão, permita que o rato se recupere na posição supina em uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus. Após um período de dois minutos de estabilização, descanse suavemente o sensor DCS sobre o hemisfério direito do crânio do mouse, de tal forma que a borda superior do sensor óptico se alinha com a parte de trás do olho e a lateral do sensor se alinha ao longo da linha média. Desarme a mão sobre o sensor para protegê-lo da luz do quarto e adquirir cinco segundos de dados.Em seguida, reposicione o sensor sobre o hemisfério esquerdo e adquira cinco segundos de dados do hemisfério esquerdo. Para avaliar a produção de citocina multiplexada e proteína fosfo, adicione 150 microliters de tampão de lise mista por aproximadamente três miligramas de tecido cerebral animal colhido. E use uma ponta de pipeta de 1.000 microliter para triturar mecanicamente o tecido 15 a 20 vezes.Coloque as amostras homogeneizadas em um rotador por 30 minutos a quatro graus Celsius antes de coletar os detritos teciduais por centrifugação. Transfira os supernantes em novos tubos e centrifufique as amostras para remover qualquer precipitado restante. Transfira os supernantes para novos tubos e determine a concentração de proteínas pelo ensaio BCA de acordo com os protocolos padrão.Prepare 25 microliters de cada amostra na concentração de proteína ideal, conforme determinado pela análise linear da faixa em novos tubos. Utilizando tampão de ensaio para normalizar o volume total de cada amostra para 25 microliters. Para preparar uma placa de ensaio, adicione 200 microliters de tampão de lavagem a cada poço de uma placa de 96 poços e agite a placa em um agitador por 10 minutos a 750 rotações por minuto.No final da incubação, decante o tampão de lavagem e bata a placa em uma toalha de papel para remover qualquer resíduo. Em seguida, adicione 25 microliters de tampão de ensaio a cada poço, seguido por 25 microliters adicionais de buffer aos poços de fundo. Adicione 25 microlitres das amostras diluídas aos poços de amostra apropriados e vórtice através de contas magnéticas multiplexadas por um minuto, antes de adicionar 25 microliters das contas completamente suspensas a cada poço.Quando todas as contas tiverem sido adicionadas, sele a placa com um selador de placa e cubra a placa com papel alumínio para uma incubação durante a noite com agitação de dois a oito graus Celsius. Na manhã seguinte, coloque a placa em um separador magnético, certificando-se de que os poços estejam alinhados com os ímãs. Após dois minutos, decante o conteúdo do poço com a placa ainda presa ao separador magnético e adicione 200 microliters de tampão de lavagem a cada poço.Depois de mantê-lo tremendo por dois minutos, coloque a placa no separador magnético por dois minutos. Em seguida, decante o conteúdo do poço com a placa ainda presa ao separador magnético e lave a placa com um novo 200 microliters de tampão de lavagem por bem, como acabou de demonstrar. Após a segunda lavagem, adicione 25 microliters de anticorpo de detecção por poço e cubra com papel alumínio para uma incubação de uma hora a 750 revoluções por minuto à temperatura ambiente.No final da incubação, adicione 25 microliters streptavidin phycoerythrin a cada poço e devolva a placa ao agitador por mais 30 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, coloque a placa no separador magnético por dois minutos antes de decantar o conteúdo do poço. Lave a placa duas vezes com 200 microliters de tampão de lavagem fresco por lavagem e adicione 75 microliters do fluido de acionamento apropriado a cada poço.Em seguida, suspenda novamente as contas do agitador da placa por cinco minutos em temperatura ambiente e leia as placas do analisador de acordo com as instruções do fabricante. Nesta análise, o fluxo sanguíneo cerebral foi medido com espectroscopia de correlação difusa quatro horas após a última lesão. O índice de fluxo sanguíneo cerebral e o índice médio de fluxo cerebral para cada hemisfério podem então ser determinados.Uma análise de alcance linear pode ser conduzida para determinar uma massa de carregamento de proteínas apropriada antes da coleta de dados de todas as amostras. Os dados de citocinas podem ser preparados subtraindo as medições de fundo dos dados da amostra e, em seguida, computando dados de pontuação Z para cada anolito. A regressão parcial de quadrados pode ser conduzida utilizando-se um marcador de ativação microglial fagocite ou outra variável de interesse como variável de resposta, e as medidas de citocinas como as variáveis preditoras.A rotação Varimax pode ser realizada para maximizar a covariância dos dados na variável latente um, com as medidas do marcador de ativação. Pesos de carga elevados em variável latente correspondem às expressões de citocina mais associadas à alta expressão do marcador de ativação. Regressões lineares entre o marcador de ativação e citocinas ilustram que as citocinas com maiores pesos de carga em variáveis latentes também foram estatisticamente significativas para esta análise.Embora tenhamos focado este protocolo em lesões cerebrais traumáticas, esses métodos são amplamente generalizáveis ao estudo de uma infinidade de condições patológicas que afetam o cérebro. Usamos essas técnicas para nos ajudar a identificar alvos tratáveis para modular em experimentos futuros para estabelecer relações mecanicistas causais e, finalmente, com o objetivo de desenvolver novas estratégias terapêuticas para lesões cerebrais traumáticas leves.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.0K Views.  Georgia Institute of Technology and Emory University. These methods can be used to characterize neuroinflammatory and hemodynamic responses to brain injury as part of a multivariate system analysis using partial least squares regression. These techniques are used to give more of a holistic view of the brain's response to injury. To induce an injury, confirm a lack of response to toe pinch in an anesthetized mouse and place mouse in the prone position on the center of a thin membrane.Using both hands to hold the tissue taught, secure the m...