Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da explosão lesiva lesão cerebral traumática e pode ser usado para testar drogas neuroprotetoras antes do uso de modelos vivo mais complexos. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa um instrumento de laboratório para expor o tecido cerebral em massa in Vitro a uma onda de choque usando um protocolo simples e de alto rendimento que permite a criação de uma lesão reprodutível. Primeiro, insira anéis de aço inoxidável feitos sob medida nos poços de uma placa de seis poços.
Em seguida, adicione meio experimental pré-aquecido sem soro com iodeto de propídio aos poços garantindo que o nível médio não atinja acima do entalhe do anel. Transfira a placa para a incubadora por uma hora para garantir que o meio esteja a 37 graus Celsius antes que as pastilhas de cultura tecidual sejam transferidas. Após uma hora, transfira as pastilhas de cultura tecidual com fatias organotipípicas de seus pratos de crescimento para os anéis na placa de seis poços.
Faça um ponto na borda da inserção na posição de três horas com uma caneta marcadora permanente para facilitar o retorno das pastilhas à sua posição original, em seguida, rotule cada placa de seis poços com um nome e data únicos e faça um mapa dos poços de cada placa, nomeando cada poço com uma letra e cada fatia no poço com um número para que cada fatia tenha um identificador único. Incubar a 37 graus Celsius por uma hora para garantir que as fatias estejam a 37 graus Celsius imediatamente antes da imagem. Uma hora após a transferência para o meio experimental, avalie a saúde da fatia por imagem rápida de cada fatia individual e sequencialmente sob baixa potência.
Use um microscópio de fluorescência equipado com um filtro de excitação e emissão apropriado idealmente em uma sala escura ou em uma sala com pouca luz. Mantenha a tampa na placa durante a imagem. Alguma condensação pode se acumular no interior da tampa.
Se isso acontecer, use brevemente um secador de cabelo na configuração baixa do lado de fora da tampa. Certifique-se de que as condições de imagem são idênticas em dias diferentes e entre experimentos. Na linha de base, fatias saudáveis mostram muito pouca coloração fluorescente.
As fatias que exibem áreas de denso de coloração vermelha indicam viabilidade comprometida e devem ser excluídas de análises posteriores. Para comparação, a fluorescência da fatia ferida da explosão às 72 horas é mostrada aqui. Imediatamente após a imagem, remova uma inserção de cultura tecidual da placa de seis poços e transfira cuidadosamente a inserção para um saco de polietileno estéril contendo 20 mililitros de médios experimentais pré-aquecidos com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono.
Remova cuidadosamente todas as bolhas de ar e sele o saco estéril torcendo a parte superior e aplicando um grampo plástico. Certifique-se de que cada saco estéril está corretamente rotulado com a placa e identificação do poço. Depois de transferir cada inserção de cultura tecidual para um saco estéril individual, coloque os sacos e as seis placas de poço com meio experimental na incubadora de 37 graus Celsius.
Após uma hora, embale cuidadosamente os sacos estéreis com as pastilhas de cultura tecidual em caixas plásticas dentro de uma caixa regulada térmica cheia com a água ionizada a 37 graus Celsius. A água deve manter as fatias organotípicas à temperatura fisiológica durante todo o protocolo de exposição à onda de choque. Use botas de proteção de aço, um casaco de laboratório e luvas durante a preparação do tubo de choque e a exposição à onda de choque.
Use uma haste de emolduramento para fixar a estrutura do suporte do saco estéril à flange distal do tubo de choque, garantindo que o orifício central esteja alinhado com a saída do tubo de choque. O sensor um, um transdutor de pressão, está localizado na parte média da seção acionada, e o sensor dois está na flange distal do tubo de choque. Conecte esses transdutores de pressão a um osciloscópio através de uma unidade de energia de origem atual e ligue o osciloscópio.
Certifique-se de que a válvula solenoide e o controle de fluxo do tubo de choque estejam fechados e, em seguida, abra a linha de ar comprimida externa e carregue a válvula solenoide para 2,5 bar. Abra a válvula de segurança do cilindro de ar comprimido e abra lentamente o regulador de pressão para aumentar a pressão para aproximadamente cinco barras. Em seguida, prepare os diafragmas cortando folhas de poliéster de 23 mícrons de espessura em quadrados de 10 por 10 centímetros.
Prepare as alças da fita autoclave e coloque-as na parte superior e inferior de cada diafragma. Posicione um diafragma na brecha e certifique-se de que eles estão centrados. Em seguida, aperte o diafragma usando quatro parafusos M24 e porcas.
Fore-os sequencialmente de forma diagonalmente simétrica, garantindo que os diafragmas estejam livres de rugas. Fixar um saco estéril em uma posição vertical na estrutura do suporte garantindo que a superfície da cultura tecidual insira com as fatias hipocampais organotípicas esteja voltada para a saída do tubo de choque e a inserção da cultura tecidual esteja centrada dentro do saco estéril. Para a configuração do diafragma duplo, a pressão de estouro depende do diferencial de pressão do gás entre o motorista e a câmara de dupla ruptura.
Portanto, para que os diafragmas estourem de forma controlada, a válvula de segurança de dupla brecha é aberta manualmente assim que as pressões alvo são atingidas. Coloque os protetores de ouvido e os óculos de segurança se ainda não estiver desgastado. Feche a válvula solenoide.
Ligue a unidade de energia de origem atual para adquirir os dados de ondas de choque. Manipule o botão de controle de fluxo no painel de controle do tubo de choque para pressurizar lentamente a seção de volume do motorista do tubo de choque para uma configuração de diafragma única ou tanto a seção de volume do motorista quanto a seção de dupla violação do tubo de choque para configuração de diafragma duplo. Assim que o diafragma se rompe, fechou rapidamente o fluxo de ar comprimido usando o botão de fluxo e abra a válvula solenoide.
A combinação ideal de parâmetros de ondas de choque deve ser suficiente para causar lesões teciduais, mas não tão altas que causa a cultura tecidual inserir ou distorção ou ruptura do saco estéril. Depois de expor cada fatia a uma única onda de tubo de choque, devolva-a imediatamente à caixa regulada térmica. Em seguida, pegue o próximo saco estéril da caixa e aperte-o na moldura do suporte.
Execute o interruptor suavemente e rapidamente para evitar o resfriamento do meio experimental, pois temperaturas abaixo de 37 podem interferir no desenvolvimento de lesões. Uma vez que todas as inserções de cultura tecidual tenham sido expostas a uma onda de choque ou protocolo falso, retorne a cultura tecidual inserindo aos seus poços na placa original de seis poços e retorne à incubadora até novas imagens. Esta imagem é um exemplo representativo de uma onda de choque obtida usando 23 mícrons de poliéster de espessura com 55 quilopascal pico de sobrepressão.
A velocidade da onda de choque foi de 440 metros por segundo. Tanto ondas de choque de 50 e 55 quilopascal causaram ferimentos significativos que se desenvolveram ao longo do protocolo de 72 horas quando comparado com o grupo falso. A lesão resultante de um pico de 55 quilopascal de exposição à onda de pressão excessiva foi significativamente maior do que depois de 50 quilopascal em 48 horas e 72 horas, demonstrando que o desenvolvimento da lesão é proporcional à intensidade da onda de choque.
Esta imagem mostra uma fatia 72 horas depois de uma explosão de 50 quilopascal. Um alto nível de lesão difusa é visível. A lesão é mais pronunciada após uma explosão de pressão excessiva de 55 quilopascal.
Esta imagem de fluorescência de iodida propidato mostra uma fatia organotípica de um experimento falso. A fatia falsa mostra baixos níveis de fluorescência. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter uma técnica asséptica em todo para evitar a contaminação do tecido e manipular as culturas teciduais rapidamente, mas muito suavemente para evitar danos celulares não intencionais.
Após este procedimento, outros métodos como a coloração da imunofluorescência podem ser realizados para responder a perguntas adicionais como quais são os mecanismos de morte celular envolvidos na lesão cerebral traumática induzida pela explosão? Esta técnica permite um alto ensaio de rendimento para pesquisadores no campo da neuroproteção explorar o potencial de drogas para evitar a propagação da morte celular e tecido cerebral após a exposição a ondas de choque de explosão.
