रक्त-रीढ़ की हड्डी की बाधा कसकर बंधन है और इसमें सीमित पारगम्यता है। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को माइक्रोबबल और केंद्रित अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके रक्त-रीढ़ की हड्डी की बाधा को सुरक्षित और क्षणिक रूप से खोलने की अनुमति देता है। यह तकनीक रक्त-रीढ़ की हड्डी की बाधा को लक्षित रीढ़ की हड्डी खंड में स्थानीयकृत करने की अनुमति देती है।
इसके अतिरिक्त, दृश्य अवलोकन या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से व्यवधान की आसानी से पुष्टि की जा सकती है। ट्यूमर, शोष या चोट के उपचार के लिए रीढ़ की हड्डी में जीन थेरेपी, या दवाओं के वितरण में सुधार करने में इसकी क्षमता के लिए इस प्रोटोकॉल का पता लगाया जा सकता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन मेघना भीमरेड्डी करेंगे।
मेरी प्रयोगशाला से एक तारकीय एमडी छात्र, जो दैनिक आधार पर इंजीनियरिंग और चिकित्सा के बीच की खाई को पाटता है। शुरू करने के लिए, रक्त-रीढ़ की हड्डी की बाधा, या चूहों में बीएससीबी उद्घाटन प्राप्त करने के लिए पर्याप्त विनिर्देशों के साथ एक केंद्रित अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर सिस्टम प्राप्त करें। ट्रांसड्यूसर पर 3 डी मुद्रित जांच धारक और पानी शंकु चिपकाएं।
सुनिश्चित करें कि शंकु और ट्रांसड्यूसर के बीच एक वाटरटाइट सील है। रबर बैंड का उपयोग करके पानी के शंकु के नीचे निष्फल, 50 माइक्रोन मोटी, ध्वनिक रूप से पारदर्शी, पॉलिएस्टर झिल्ली को ठीक करें। इनलेट और आउटलेट ट्यूबों का उपयोग करके डिगैस्ड और विआयनीकृत पानी के साथ पानी के शंकु को भरें।
शंकु के अंदर हवा के बुलबुले से बचें, क्योंकि वे ट्रांसड्यूसर और लक्ष्य के बीच ध्वनिक युग्मन को बाधित कर सकते हैं। इस स्तर पर, मायलर झिल्ली को थोड़ा फुलाया जाना चाहिए। तरंग जनरेटर और रेडियो आवृत्ति ड्राइव एम्पलीफायर युक्त ड्राइविंग उपकरण को ट्रांसड्यूसर से कनेक्ट करें।
स्टीरियोटैक्टिक आर्म को फिक्सेशन प्लेट में ठीक करें और प्रोब होल्डर को बांह से संलग्न करें। एनेस्थेटाइज्ड स्प्राग-डॉवले मादा चूहे के वजन को रिकॉर्ड करें, और संज्ञाहरण की पुष्टि करने के लिए पैर की अंगुली और पूंछ पिंच परीक्षण करें। निर्धारण प्लेट पर एक हीटिंग पैड और बाँझ शोषक पैड रखें।
चूहे को शोषक पैड पर रखें। आंखों का मलहम लगाएं और शरीर के तापमान की निगरानी के लिए एक रेक्टल थर्मामीटर रखें। चूहे की अंतिम पसली को थपथपाना, जो 13 वें वक्ष कशेरुक में रीढ़ से जुड़ा होता है।
अंतिम पसली और गर्दन के बीच पृष्ठीय सतह से फर को शेव करने के लिए एक इलेक्ट्रिक रेजर का उपयोग करें। उजागर त्वचा को 10% आयोडोपोविडोन में डूबी धुंध के साथ पोंछें। आईरिस कैंची का उपयोग करके एक मध्य रेखा चीरा बनाएं और प्रावरणी के माध्यम से विच्छेदन करें जब तक कि स्पिनस प्रक्रियाओं और लैमिना को उजागर न किया जाए।
हड्डी को ऑफसेट बोन निपर्स और एंगल ब्लेड आईरिस कैंची के साथ हटा दें, जब तक कि रीढ़ की हड्डी उजागर न हो जाए। लैमिनेक्टॉमी से सटे स्पिनस प्रक्रियाओं को दबाकर चूहे को निर्धारण प्लेट में सुरक्षित करें। फिर रीढ़ की हड्डी को तना हुआ बनाने के लिए क्लैंप पर थोड़ा सा खींचें।
स्टीरियोटैक्टिक आर्म के साथ ट्रांसड्यूसर की स्थिति को समायोजित करें जब तक कि यह लैमिनेक्टॉमी के ठीक ऊपर स्थित न हो। लेजर उपकरण को पानी के शंकु के तल पर चिपकाएं और इसे तब तक कम करें जब तक कि लेजर बिंदु दिखाई न दे। फिर ट्रांसड्यूसर की पार्श्व स्थिति को समायोजित करें जब तक कि लेजर बिंदु बीएससीबी व्यवधान के लिए लक्ष्य स्थान से ऊपर न हो।
लेजर उपकरण को हटा दें और हवा के बुलबुले पेश किए बिना, डिगैस्ड अल्ट्रासाउंड जेल के साथ शंकु और रीढ़ की हड्डी के बीच की जगह को भरें। ट्रांसड्यूसर पावर आउटपुट पर सोनिकेशन के लिए पैरामीटर सेट करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक माइक्रोबबल समाधान तैयार करें।
सफल पूंछ शिरा कैथीटेराइजेशन की संभावना बढ़ाने के लिए, पूंछ को गर्म पानी में डुबोएं और नसों के व्यास को बढ़ाने के लिए पूंछ के आधार पर एक टॉर्निकेट रखें। फिर एक 22 गेज टेल नस कैथेटर डालें और 0.2 मिलीलीटर हेपरिनाइज्ड सेलाइन के साथ फ्लश करें। कैथेटर में 3% इवांस ब्लू डाई, या ईबीडी के प्रति किलोग्राम एक मिलीलीटर इंजेक्ट करें।
फिर कैथेटर को 0.2 मिलीलीटर हेपरिनाइज्ड सेलाइन के साथ फ्लश करें। चूहे की त्वचा, आंखों या पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी की नस में नीले रंग के परिवर्तन की जांच करके सफल पूंछ नस कैथीटेराइजेशन की पुष्टि करें। कैथेटर में माइक्रोबबल के 0.2 मिलीलीटर बोलस इंजेक्ट करें और सोनिकेशन शुरू करने से पहले हेपरिनाइज्ड सेलाइन के साथ फ्लश करें।
चूहे को यूथेनाइज करने के बाद, रीढ़ की हड्डी को हटा दें और इसे रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में रखें। अगले दिन पैराफॉर्मलडिहाइड को पीबीएस से बदलें। बीएससीबी व्यवधान की कल्पना करने के लिए, रेजर ब्लेड का उपयोग करके सोनिकेशन के स्थान के आसपास दो सेंटीमीटर खंड को अलग करें।
माइक्रोटोम का उपयोग करके अनुभाग को 10 माइक्रोन मोटे वर्गों में विभाजित करें और हेमटोक्सीलिन ईओसिन दाग के साथ दाग दें। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए, रीढ़ की हड्डी के खंड वाले स्लाइड को डिपैराफिनाइज्ड करें, और बढ़ते माध्यम में घुलने वाले डीएपीआई के 25 माइक्रोलीटर के साथ काउंटरस्टेन करें। ब्लीचिंग को रोकने के लिए अंधेरे में 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अनुभागों को इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन बाद, सभी स्लाइडों को चित्रित करने के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके हेमटोक्सीलिन और ईओसिन दाग वाली स्लाइड की छवि बनाएं। रीढ़ की हड्डी की वाहिका लैमिनेक्टॉमी के बाद दिखाई देती है, और पीछे की रीढ़ की नस को दिखाती है, जिसमें कई छोटी वाहिकाएं पार्श्व रूप से विकीर्ण होती हैं।
ईबीडी के अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद, आसपास के ऊतक और रीढ़ की हड्डी वाहिका नीली दिखाई दी। सोनिकेशन के बाद, लक्षित स्थान पर एक नीला धब्बा दिखाई देता है, जो बीएससीबी व्यवधान के कारण सफेद पैरेन्काइमा में ईबीडी के बहिर्वाह का संकेत देता है। कम तीव्रता वाले केंद्रित अल्ट्रासाउंड, या एलआईएफयू सोनिकेशन के साथ चूहों से उत्पादित रीढ़ की हड्डी ने रीढ़ की हड्डी में ईबीडी के स्पष्ट बहिर्वाह की पुष्टि की।
जबकि एलआईएफयू उपचार के बिना नकारात्मक नियंत्रित चूहों ने ईबीडी एक्स्ट्रावेसन नहीं दिखाया। एलआईएफयू सोनिकेशन के साथ रीढ़ की हड्डी ने ईबीडी ऑटोफ्लोरेसेंस की काफी अधिक तीव्रता दिखाई, उन डोरियों की तुलना में जिन्हें सोनिकेशन नहीं मिला। दोनों में मौजूद DAPI की समान तीव्रता के साथ।
हेमटोक्सीलिन और ईओसिन विश्लेषण ने सोनिकेटेड स्थानों में कोई न्यूरोनल क्षति, रक्तस्राव या गुहा घावों का खुलासा नहीं किया। सर्जिकल मिसहैंडलिंग के कारण घायल डोरियों के उदाहरण, और उच्च शक्ति वाले सोनिकेशन को तुलना के रूप में दिखाया गया है। माइक्रोबबल और एलआईएफयू उपचार प्राप्त करने वाले चूहों में, मोटर स्कोर, प्री-सोनिकेशन, पोस्ट-सोनिकेशन और पांच दिन की जीवित रहने की अवधि के दौरान कोई बदलाव नहीं देखा गया।
सोनिकेशन विश्लेषण से पहले, दौरान और बाद में रीढ़ की हड्डी के तापमान में न्यूनतम परिवर्तन देखे गए। लैमिनेक्टॉमी के दौरान कॉर्ड को सर्जिकल क्षति को सीमित करना महत्वपूर्ण है। माइक्रोस्कोपी के साथ एच और ई दाग वाले वर्गों की कल्पना करना, इंगित करेगा कि क्या कोई नुकसान हुआ है।
रक्त-रीढ़ की हड्डी बाधा व्यवधान के बाद, फोकस अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके, जानवरों को एंटीनोप्लास्टिक एजेंटों, या जीन थेरेपी के साथ इंजेक्ट किया जा सकता है। परिणाम यह निर्धारित करेगा कि क्या यह तकनीक चिकित्सीय वितरण में सुधार कर सकती है, और रीढ़ की हड्डी विकृति की स्थापना में अस्तित्व का विस्तार कर सकती है।