التمهيدي لقطة فرعي : استرجاع المستهدفة تسلسل الحمض النووي من مصادر المتدهورة بالديون

Summary

نقدم وسيلة لاسترجاع الحمض النووي المستهدف القديمة تسلسل ، والذي كنا لإعادة بناء كامل الجينوم الميتوكوندريا من خمسة أفراد نندرتل. المقارنة بين هذه المتتاليات مع البشر يومنا هذا قد يوحي بأن Neandertals مدة طويلة انخفاض حجم السكان فعالة.

Abstract

نقدم وسيلة لاسترجاع تسلسل الحمض النووي المستهدف من مصادر الحمض النووي التي تتدهور بشكل كبير وتلوث جرثومي مع الحمض النووي ، كما هي الحال في العظام القديمة. الأسلوب يقلل بدرجة كبيرة من الدمار ومطالب عينة التسلسل النسبي لتوجيه PCR أو نهج التسلسل طلقات نارية. استخدمنا هذا الأسلوب لإعادة بناء كاملة الميتوكوندريا الحمض النووي (و mtDNA) الجينوم خمسة Neandertals من جميع أنحاء نطاقها الجغرافي. كان التنوع الجيني للو mtDNA Neandertals أواخر ثلاث مرات تقريبا أقل من البشر الحديثة المعاصرة. جنبا إلى جنب مع تحليل تطور البروتين و mtDNA ، وهذه البيانات تشير إلى أنه على المدى الطويل حجم السكان الفعلي Neandertals كان أصغر من أن البشر والقردة العليا الحديثة موجودة.

Protocol

وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في بريغز وآخرون ، علم 325 (5938). 318-321 (2009) .

الكواشف اللازمة :

• AmpliTaq البلمرة الذهب الحمض النووي
• 10X PCR GeneAmp الاحتياطي الثاني
• ₂ MgCl 25mM
• dNTP المزيج ، 25 مم كل
• جيش صرب البوسنة ، و 10 ملغ مل - ¹ في المياه
• البيولوجيا الجزيئية في الصف المياه
• EB العازلة (المتوفرة مع مجموعة MinElute تنقية PCR) و 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.5
• MinElute أدوات تنقية PCR
• M - 270 streptavidin Dynabeads
• 2X وتجليد واغسل (BW) العازلة (2 M كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي تريس - CL ، 1 ملم EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 0.2 ٪ توين 20)
• 1X وتجليد واغسل (BW) العازلة (2X 2X BindWash العازلة المخفف في الماء)
• اغسل الساخنة (الأب) العازلة (2.5mM MgCl ، 1X طق الذهب العازلة ، 0.1 ٪ توين 20)

للحصول على معلومات تتعلق بالشركة المصنعة غير القياسية الكواشف والمعدات انظر الجدول في وقت لاحق.

1) مكتبة التضخيم

1. القالب الحمض النووي هنا هو 454 مكتبة على استعداد من مصدر نسخ الحمض النووي منخفضة كما هو موضح في عدد (رولاند وHofreiter ، 2007a ، 2007b) و (Maricic وPääbo ، 2009). لتضخيم مكتبة بأكملها ، وإعداد المزيج PCR التالية :

   الكاشف	في رد فعل ميكرولتر
   ماء	45
   10X جين الأمبير PCR العازلة الثاني	10
   MgCl 2 (25mM)	10
   BSA (10 ملغ / مل)	2
   dNTPs (25 مم لكل منهما)	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 primer/10uM emPCR رفس	3
   AmpliTaq بوليميريز الحمض النووي الذهب (5 U / ميكرولتر)	1
   454 قالب الحمض النووي المكتبة	25
   مجموع	100

2. استخدام البرنامج PCR التالية في cycler الحرارية لتضخيم دورات 14
   1. 95 درجة مئوية 12min
   2. 95 درجة مئوية 30S
   3. 60 درجة مئوية (درجة الحرارة المرغوبة أو الصلب) 1 دقيقة
   4. 72 ° C 1 دقيقة
   5. انتقل إلى 2 (× 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 درجة مئوية ∞
3. تنقية رد فعل أكثر من عمود الدوران Qiagen MinElute وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أزل في 50 EB العازلة ميكرولتر.
4. تحديد كمية المنتج تنقية تضخيم فضلا عن قسامة من المكتبة unamplified مع qPCR (ماير وآخرون ، 2007). إذا كان المنتج قد تضخمت أكثر من 1 10 ¹² X نسخ لكل المجاهدين ، والحد من كمية القالب في خطوة تمهيدية لضمان تمديد التالية التي تمت إضافتها لا يزيد عن 2 X 10 ¹² نسخة منها إلى رد فعل التمهيدي تمديدها.

2) ملحق التمهيدي

1. تحضير مزيج الرئيسي للعدد المطلوب من ردود الفعل.

   الكاشف	في رد فعل ميكرولتر
   ماء	45
   10X جين الأمبير PCR العازلة الثاني	10
   MgCl 2 (25mM)	10
   BSA (10 ملغ / مل)	2
   dNTPs (25 مم لكل منهما)	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 primer/10uM emPCR رفس	3
   AmpliTaq بوليميريز الحمض النووي الذهب (5 U / ميكرولتر)	1
   454 قالب الحمض النووي المكتبة	25
   مجموع	100

2. تشغيل البرنامج التالي في Thermocycler للتفاعل التمهيدي تمديد واحد :
   1. 95 درجة مئوية 12min
   2. 60 درجة مئوية (أو الصلب الخاص PEC التمهيدي مؤقت إذا كان مختلفا) 1 دقيقة
   3. 72 ° C 5 دقائق
   4. 72 درجة مئوية إلى الأبد!
      
      خطوة حاسمة احتفظ رد فعل بعد التمديد في 72 درجة مئوية. ثم مباشرة أو ماصة 150ul PBI PB العازلة لتنقية MinElute QIAGEN في الأنابيب قبل إزالة من كتلة الحرارة. هذا مهم لتجنب غير محددة التمهيدي الصلب والاستيلاء على الخليط يبرد.
3. تنقية رد فعل أكثر من عمود الدوران Qiagen MinElute ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أزل في 50 EB ميكرولتر.

3) لقطة ملحق المنتج

1. Resuspend حل سهم M - 270 التي vortexing الخرز. إخراج 25 حبة تعليق ميكرولتر لكل عينة. تغسل حبات مرتين مع BW 500ul العازلة 2X وresuspend العازلة في 25 ميكرولتر 2xBW لكل عينة.
2. إضافة 25 شطافة ميكرولتر من الخطوة 2.3 إلى 25 حبة تعليق ميكرولتر من الخطوة 3.1. المزيج ثم تدوير : 15 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   
   وأوصت : الحفاظ على ما تبقى من المجاهدين 5 شطافة من الخطوة 2.3 لqPCR الكمي.
   
   
3. نقل الخليط كله لأنبوب 1.5ml الطازجة (وهذا يساعد على خفض المرحل من شظايا المكتبة غير المستهدفة). بيليه وطاف به في مجمع الجسيمات المغناطيسية (MPC) وتجاهل طاف.
4. يغسل 5 مرات مع العازلة 500 1xBW ميكرولتر (يغسل العديد من مساعدة لإزالة الخلفية قدر ممكن). بعد الخطوة غسل الماضي ، وتدور باستمرار لفترة وجيزة ، وإزالة آثار الماضي وطاف.
5. إضافة 500μl 1X الساخن اغسل (الأب) العازلة. يهز لمدة 2 دقيقة على 65 درجة مئوية (أو 5C فوق تيم التمهيدي PEC) على كتلة الحرارية. إزالة طاف بسرعة بعد ذلك ، للحد من التبريد. (هذه الخطوة لإزالة شظايا الخلفية لا يزال يرتبط مع الاشعال PEC ولكن ليس في الواقع على تمديد خلال خطوة التمديد). إزالة آخر آثار طاف.
6. Resuspend الكرية حبة العازلة في 30 EB ميكرولتر. نقل الخليط كله لأنبوب 1.5ml الطازجة (وهذا يساعد على خفض المرحل من شظايا المكتبة غير المستهدفة). في احتضان 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في cycler الحراري للشطف. لجنة السياسة النقدية في مكان وإزالة طاف ، مع الحرص على ترك وراء الخرز.

4) لقطة التضخيم المنتج

1. تحضير مزيج PCR الرئيسي للعدد المطلوب من العينات.

   الكاشف	في رد فعل ميكرولتر
   ماء	45
   10X جين الأمبير PCR العازلة الثاني	10
   MgCl 2 (25mM)	10
   BSA (10 ملغ / مل)	2
   dNTPs (25 مم لكل منهما)	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 primer/10uM emPCR رفس	3
   AmpliTaq بوليميريز الحمض النووي الذهب (5 U / ميكرولتر)	1
   Eluted التقاط المنتج	25
   مجموع	100

2. استخدام البرنامج PCR التالية في cycler الحرارية لتضخيم دورات (14) :
   1. 95 درجة مئوية 12min
   2. 95 درجة مئوية 30S
   3. 60 درجة مئوية (درجة الحرارة المرغوبة أو الصلب) 1 دقيقة
   4. 72 ° C 1 دقيقة
   5. انتقل إلى 2 (× 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 درجة مئوية ∞
3. تنقية رد فعل على عمود MinElute Qiagen تدور السيليكا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أزل العازلة في 50 EB ميكرولتر. يمكن أن تكون المنتجات المستخدمة حاليا إما عن الجولة الثانية من التقاط الصور ، بدءا من الخطوة 2.1 ، أو دخلت مباشرة في البروتوكول 454 PCR مستحلب ، على التسلسل.

ممثل النتائج :

فمن المستحسن عند البدء مع بروتوكول PEC لأداء رد الفعل الأول على التقاط حيث كمية صغيرة من الإيجابية تحكم تسلسل المستهدفين (على سبيل المثال منتج PCR ~ 100bp -- 1 بيكوغرام يكفي بسهولة) وتخلط مع العادي وأوصت تضخيم كمية 454 قالب مكتبة (راجع الخطوة 2.1) ، ويتم تنفيذ التقاط مع التمهيدي PEC واحد تهدف إلى الاستيلاء على مراقبة المنتج إيجابية. يمكن استخدامها إذا تم تنفيذ هذا رد فعل السيطرة ، سواء كانت إيجابية مع qPCR التحكم الخاصة و 454 محول أزواج محددة التمهيدي لقياس كمية من 'هدف السيطرة" في مقابل الخلفية في رد فعل التمهيدي تمديد المنقى (1.3) ، التمهيدي المنتج التمديد (2.3 ) والمنتج eluted التقاط حبة (3.6). في هذه الطريقة ، يمكن كل من فعالية إزالة الخلفية ("خصوصية") وكفاءة الاسترداد المستهدفة ("حساسية") في ظروف تجريبية الخاص تقاس مباشرة.

ناجح PEC بروتوكول ديه عادة الخصائص التالية --

الحساسية (تقاس كمية هدف السيطرة من خلال الإبقاء على البروتوكول) :
المبلغ الإجمالي المستهدف من التحكم في المنتج eluted التقاط حبة (3.6) = ~ 1-20 ٪ من مجموع المبلغ في تنقية التمهيدي رد فعل ملحق (2.3).

الخلفية (التي تقاس 454 emPCR الزوج التمهيدي) :
المبلغ الإجمالي للخلفية في التقاط حبة eluted المنتج (3.6) <0.01 ٪ من مجموع المبلغ في تنقية التمهيدي رد فعل ملحق (2.3).

إذا كان هناك أقل من 1 ٪ من الهدف المتبقية في المنتج النهائي ، قد يكون خطوة التمديد التمهيدي ناجحة ، وينبغي التحقيق فيها.

إذا كان هناك أكثر بكثير من 0.01 ٪ من الخلفية المتبقية في المنتجات النهائية ، قد يكون تم تنفيذ الخطوات غسل غير صحيح ويجب التحقيق فيها.

Discussion

الأسلوب PEC بسيطة وسريعة وحساسة ومحددة. ولذلك فإننا نتصور أن الكتاب تطبيقات متعددة خارج الحمض النووي القديم ، مثل الاستيلاء على أجزاء صغيرة من الحمض النووي الريبي RNA مكتبة والاستجواب من التباين الهيكلي في عينة مجمعة او اعتقال 16S (أو مواضع أخرى) التنوع من عينة metagenomic. نقطة واحدة عن ذكره هو أن حساسية التقاط يصبح أقل حيث أن عدد أجهزة الاشعال PEC في زيادة التفاعل المتعدد الالتقاط. وبالتالي لا PEC مثاليا للقبض على المناطق التقاط كبيرة جدا (مثل megabase أو أكثر) ، ولكن بشكل جيد للغاية يناسب للقبض على المناطق المستهدفة صغيرة أو حتى مواقف العديد من الأفراد من الحزب الوطني الاسكتلندي بطريقة سريعة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2	Applied Biosystems	N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
M-270 streptavidin beads	Invitrogen	653.05
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator	Invitrogen	120.02D