Captura Primer Extensão: Recuperação Sequence alvejado a partir de Fontes de DNA altamente degradadas

Resumo

Nós apresentamos um método de recuperação de seqüência de DNA alvo antigo, que usamos para reconstruir o genoma mitocondrial completo de cinco indivíduos Neandertal. Comparação dessas seqüências com os seres humanos hoje sugere que os neandertais tinham um longo prazo o tamanho da população de baixa eficácia.

Resumo

Nós apresentamos um método de recuperação de DNA alvo seqüência a partir de fontes de DNA que são altamente degradadas e contaminadas com DNA microbial, como é típico de ossos antigos. O método reduz destruição da amostra e as exigências em relação ao sequenciamento direto PCR ou abordagens seqüenciamento shotgun. Usamos este método para reconstruir a completa DNA mitocondrial (DNAmt) genomas de cinco neandertais de toda a sua abrangência geográfica. A diversidade genética do mtDNA neandertais final foi de aproximadamente três vezes menor do que o de humanos modernos contemporâneos. Juntamente com análises de mtDNA evolução de proteínas, estes dados sugerem que a longo prazo tamanho efetivo da população de neandertais era menor do que o de humanos modernos e os grandes símios existentes.

Protocolo

Este método foi utilizado na pesquisa relatada em Briggs et al. Ciência 325 (5938). 318-321 (2009) .

Reagentes necessários:

• AmpliTaq Polimerase DNA de Ouro
• 10x GeneAmp PCR buffer II
• MgCl ₂ 25mM
• dNTP mix, 25 mM de cada
• BSA, 10 mg ^ml-1 em água
• Água de biologia molecular grau
• EB buffer (fornecido com MinElute kit de purificação PCR), 10 mM Tris HCl, pH 8,5
• MinElute Kit de Purificação PCR
• M-270 estreptavidina Dynabeads
• 2x Encadernação e Wash (BW) tampão (2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,2% Tween 20)
• 1x Encadernação e Tampão de lavagem (BW) (2x tampão 2X BindWash diluída em água)
• Hot Wash (HW) buffer (2.5mm MgCl, 1X tampão Taq ouro, 0,1% Tween 20)

Para informações sobre o fabricante quanto fora do padrão de reagentes e equipamentos mais tarde tabela.

1) ampliação da Biblioteca

1. O modelo de DNA aqui é uma biblioteca de 454 preparados a partir de uma baixa fonte de DNA no número de cópias conforme descrito em (Rohland e Hofreiter, 2007a, 2007b) e (Maricic e Pääbo, 2009). Para amplificar toda a biblioteca, prepare a mistura PCR seguinte:

   Reagente	mL por reação
   Água	45
   10X Gene Amp PCR buffer II	10
   MgCl 2 (25mM)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mM cada)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR primer/10uM rvs	3
   AmpliTaq DNA polimerase Gold (5 U / mL)	1
   454 modelo de biblioteca de DNA	25
   Total	100

2. Use o programa de PCR a seguir em um cycler Thermo por 14 ciclos de amplificação
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C 30
   3. 60 ° C (temperatura de recozimento ou desejado) 1 min
   4. 72 ° C 1 min
   5. Ir para 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 ° C ∞
3. Purificar a reação sobre uma coluna de spin Qiagen MinElute acordo com as instruções do fabricante. Eluir em 50 mL tampão EB.
4. Quantificar o produto purificado amplificado, bem como uma alíquota da biblioteca sem amplificação com qPCR (Meyer et al., 2007). Se o produto amplificado tem mais de 1 X 10 ¹² cópias por ul, reduzir a quantidade de modelo na etapa seguinte Primer Extension para garantir que não mais de 2 X 10 ¹² cópias são adicionados à reação de extensão Primer.

2) Extensão Primer

1. Prepare uma mistura mestre para o número necessário de reações.

   Reagente	mL por reação
   Água	45
   10X Gene Amp PCR buffer II	10
   MgCl 2 (25mM)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mM cada)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR primer/10uM rvs	3
   AmpliTaq DNA polimerase Gold (5 U / mL)	1
   454 modelo de biblioteca de DNA	25
   Total	100

2. Executar o programa a seguir em um Termociclador para a reação única cartilha extensão:
   1. 95 ° C 12min
   2. 60 ° C (ou a sua cartilha PEC annealing temporário se for diferente) 1 min
   3. 72 ° C 5 min
   4. 72 ° C para sempre!
      
      Etapa crítica Mantenha reação após a extensão a 72 ° C. Em seguida, diretamente ou pipeta 150ul PBI PB buffer para QIAGEN purificação MinElute nos tubos antes de remover a partir do bloco de calor. Isto é importante para evitar a não-específicas de primer recozimento e captura como a mistura esfriar.
3. Purificar a reação sobre uma coluna de spin Qiagen MinElute, de acordo com as instruções do fabricante. Eluir em 50 mL EB.

3) Captura de Produto Extensão

1. Ressuspender solução estoque de M-270 contas em vortex. Retire 25 mL de suspensão talão por amostra. Lave as contas duas vezes com 500ul 2x BW buffer e ressuspender em 25 mL de buffer 2xBW por amostra.
2. Adicionar 25 mL de eluato passo 2,3-25 mL suspensão talão do passo 3.1. Misture em seguida, gire para 15 min à temperatura ambiente.
   
   Recomendações: manter restantes 5 ul do eluato a partir do passo 2.3 para quantificação qPCR.
   
   
3. Transfira a mistura toda para um novo tubo de 1,5 ml (o que ajuda a diminuir as transferências de fragmentos não-alvo da biblioteca). Pellet sobrenadante usando o coletor de partículas magnéticas (MPC) e desprezar o sobrenadante.
4. Lavar 5 vezes com 500 mL de buffer 1xBW (muitas lavagens ajudar a remover como pano de fundo tanto quanto possível). Após a etapa de lavagem passado, girar rapidamente e remover os últimos vestígios do sobrenadante.
5. Adicionar 500μl 1x Hot Tampão de lavagem (HW). Agitar durante 2 min a 65 ° C (ou 5C acima da cartilha PEC Tm) em um bloco térmico. Retire o sobrenadante rapidamente após isso, para minimizar a arrefecer. (Este passo é para remover fragmentos de fundo ainda associados com o PEC primers, mas não realmente estendido no durante a etapa de extensão). Remove os últimos vestígios do sobrenadante.
6. Ressuspender o sedimento talão em 30 mL tampão EB. Transfira a mistura toda para um novo tubo de 1,5 ml (o que ajuda a diminuir as transferências de fragmentos não-alvo da biblioteca). Incubar a 95 ° C por 3 minutos em um termociclador para a eluição. Lugar no MPC e remover o sobrenadante, tomando cuidado para deixar as contas para trás.

4) Captura de amplificação Produto

1. Prepare uma mistura mestre PCR para o número necessário de amostras.

   Reagente	mL por reação
   Água	45
   10X Gene Amp PCR buffer II	10
   MgCl 2 (25mM)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mM cada)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR primer/10uM rvs	3
   AmpliTaq DNA polimerase Gold (5 U / mL)	1
   Produto de captura eluída	25
   Total	100

2. Use o programa de PCR a seguir em um cycler Thermo por 14 ciclos de amplificação:
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C 30
   3. 60 ° C (temperatura de recozimento ou desejado) 1 min
   4. 72 ° C 1 min
   5. Ir para 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 ° C ∞
3. Purificar a reação sobre uma coluna de spin Qiagen MinElute sílica de acordo com as instruções do fabricante. Eluir em 50 mL tampão EB. O produto pode ser usado agora, quer para uma segunda rodada de captação, começando no passo 2.1, ou entrou directamente para o 454 emulsão PCR protocolo, para o seqüenciamento.

Resultados representativos:

É altamente recomendável quando se inicia com o protocolo PEC para realizar uma reação de captura de primeira, onde uma pequena quantidade de uma "seqüência alvo de controlo positivo" (por exemplo, um produto da PCR ~ 100bp - 1 picograma é facilmente suficiente) é misturado com o normal recomendado quantidade de amplificado 454 modelo de biblioteca (veja o passo 2.1), e captura é feita com um primer PEC único projetado para capturar o produto controle positivo. Se essa reação controle é realizado qPCR, com tanto positivos específicos de controle e 454 adaptador específico pares de primers podem ser usados ​​para quantificar a quantidade de 'target controle' versus fundo na reação purificada cartilha de extensão (1,3), produto de extensão de primer (2,3 ) e produto de captura eluída talão (3.6). Desta forma, tanto a eficácia da remoção de fundo ("especificidade") ea eficiência de recuperação de destino ("sensibilidade") em suas condições experimentais podem ser medidos diretamente.

A bem sucedida PEC protocolo normalmente tem as seguintes propriedades -

Sensibilidade (medido pela quantidade de alvo de controle mantidos através do protocolo):
Montante total da meta de controle em produto de captura eluída talão (3.6) = ~ 10-20% do valor total em purificada reação de extensão de primer (2.3).

Fundo (medido pelo par de primer emPCR 454):
Montante total do fundo em produto de captura eluída talão (3.6) <0,01% do montante total em reação purificada cartilha de extensão (2,3).

Se houver menos de 1% da meta remanescentes no produto final, a etapa de extensão de primer pode ter sido mal sucedido e deve ser investigada.

Se há muito mais do que 0,01% do fundo restantes nos produtos finais, os passos de lavagem pode ter sido incorrectamente realizada e deve ser investigada.

Discussão

O método PEC é simples, rápida, sensível e específico. Portanto, os autores prevêem múltiplas aplicações fora DNA antigo, como a captura de pequenos fragmentos de RNA de uma biblioteca de RNA, interrogatório de variação estrutural em uma amostra colectiva ou a captura de 16S (ou outros loci) a diversidade de uma amostra metagenomic. Um ponto a mencionar é que a sensibilidade da captura torna-se menor que o número de PEC primers em uma reação de multiplex aumenta captura. PEC não é, portanto, ideal para captura de regiões de captura muito grande (por exemplo megabase um ou mais), mas é extremamente adequado para a captura de regiões-alvo pequenas ou mesmo posições SNP de muitos indivíduos de uma forma rápida.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2	Applied Biosystems	N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
M-270 streptavidin beads	Invitrogen	653.05
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator	Invitrogen	120.02D