引物延伸捕获：从严重退化的DNA来源有针对性的顺序检索

摘要

我们提出了有针对性的古DNA序列检索，这是我们用来重建完整的线粒体基因组的5个尼安德特人的个人方法。现今人类的这些序列的比较表明，尼安德特人有一个长期的低有效的人口规模。

摘要

我们提出了有针对性的DNA DNA的来源，其中严重退化和污染的微生物DNA序列检索的方法，是典型的古代骨骼。该方法大大降低了样品的破坏和测序的要求相对于直接PCR或鸟枪测序方法。我们用这种方法来重建完整的线粒体DNA（mtDNA）的五个尼安德特人的基因组，来自全国各地其地理范围。后期尼安德特人线粒体DNA的遗传多样性比当代现代人类的大约三倍。连同线粒体蛋白质进化分析，这些数据表明，尼安德特人的长期有效的人口规模小于现代人类和现存的类人猿。

研究方案

使用这种方法是，在研究中报道的百等。，325（5938）科学 。 318-321（2009） 。

试剂要求：

• AmpliTaq黄金DNA聚合酶
• 10X GeneAmp PCR缓冲液II
• MgCl _2的 25MM
• dNTP混合液，每25毫米
• BSA，10毫克毫升水¹
• 分子生物学级水
• EB缓冲液（用MinElute PCR纯化试剂盒提供），10毫米的Tris盐酸，pH值8.5
• MinElute PCR纯化试剂盒
• M - 270链​​霉亲和素磁珠
• 2个绑定和清洗（BW）缓冲液（2 M氯化钠，10毫米，1毫米EDTA，pH值8.0，0.2％吐温20的Tris - CL）
• 1X绑定和清洗（BW）缓冲液（2X BindWash缓冲液稀释水2X）
• 热洗（硬件）缓冲液（1X的Taq黄金缓冲区，2.5mm的氯化镁，0.1％吐温20）

关于非标准试剂和仪器的制造商信息，请参见后表。

1）图书馆放大

1. 这里的DNA为模板，是一个从低拷贝数的DNA中所述的源（Rohland和Hofreiter，2007年，2007年b）和（Maricic和帕博，2009年）编写的454库。要健全整个库，准备下面的PCR混合物：

   试剂	μL，每个反应
   水	45
   10X基因AMP PCR缓冲液II	10
   氯化镁2（25MM）	10
   BSA（10毫克/毫升）	2
   dNTPs（各25毫米）	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 emPCR RVS primer/10uM	3
   AmpliTaq黄金DNA聚合酶（5 U /μL）	1
   454 DNA库模板	25
   共有	100

2. 使用以下的PCR 程序，14个循环扩增热循环仪
   1. 95 °彗星12分钟
   2. 95 °彗星30秒
   3. 60 ° C（或所需的退火温度）1分钟
   4. 72℃1分钟
   5. 2（× 13）
   6. 72 °彗星5分钟
   7. 10 °彗星∞
3. 净化根据制造商的指示超过Qiagen公司MinElute离心柱的反应。洗脱50μL缓冲液EB。
4. 量化纯化扩增产物以及定量PCR（Meyer等人，2007年）的非放大库等分。如果扩增产物已超过1 × 10 ¹²份，每UL，减少在下面的引物延伸的模板量，以确保不超过2 × ¹⁰ 12副本添加到引物延伸反应。

2）引物延伸

1. 准备一个反应所需数量的主结构。

   试剂	μL，每个反应
   水	45
   10X基因AMP PCR缓冲液II	10
   氯化镁2（25MM）	10
   BSA（10毫克/毫升）	2
   dNTPs（各25毫米）	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 emPCR RVS primer/10uM	3
   AmpliTaq黄金DNA聚合酶（5 U /μL）	1
   454 DNA库模板	25
   共有	100

2. 单引物延伸反应的热循环运行以下程序：
   1. 95 °彗星12分钟
   2. 60 ° C（或您的PEC的引物退火温度不同）1分钟
   3. 72℃5分钟
   4. 72 °彗星永远！
      
      关键的一步延伸反应后保持在72 ° C 。然后直接移液器150ul的PBI或PB缓冲液从加热块中取出之前QIAGEN公司MinElute管道进入净化。这一点很重要，以避免非特异性引物退火和捕获的混合物冷却。
3. 净化超过Qiagen公司MinElute离心柱的反应，根据制造商的指示。在50μL的EB洗脱。

3）延伸产品捕捉

1. 悬浮原液的M - 270珠震荡。取出25μL珠每个样品悬挂。珠两次洗500ul 2X BW缓冲和重悬在每个样品25μL2xBW缓冲区。
2. 从步骤2.3中添加25μL洗脱液25μL 步骤 3.1珠悬挂。然后旋转混合1在室温下5分钟。
   
   建议 ：保持其余的步骤定量PCR定量2.3 5洗脱液UL。
   
   
3. 整个混合物转移到一个新的1.5毫升管（这有助于减少非目标库片段结转）。颗粒的上清液用磁性粒子收集器（MPC），弃上清。
4. 洗净用500μl1xBW缓冲区（许多清洗有助于消除尽可能多的背景）的5倍。在最后的洗涤步骤，降速简要上清液中删除的痕迹。
5. 加入500μL1X热洗（硬件）缓冲区。摇2分钟，在65 ° C（或以上PEC底漆TM 5C）在热块。快速去除上清，在此之后，，以尽量减少降温。 （这一步是删除仍然PEC的引物，但实际上并不在延伸扩展的背景片段）。除去上清的最后的痕迹。
6. 在30μL的EB缓冲液重悬磁珠颗粒。整个混合物转移到一个新的1.5毫升管（这有助于减少非目标库片段结转）。在95℃孵育3分钟，在热循环仪进行洗脱。放置在MPC和去除上清，照顾身后留下的珠。

4）Capture产品放大

1. 准备一个样品所需数量的PCR扩增预混。

   试剂	μL，每个反应
   水	45
   10X基因AMP PCR缓冲液II	10
   氯化镁2（25MM）	10
   BSA（10毫克/毫升）	2
   dNTPs（各25毫米）	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 emPCR RVS primer/10uM	3
   AmpliTaq黄金DNA聚合酶（5 U /μL）	1
   洗脱捕捉产品	25
   共有	100

2. 在14个循环扩增热循环仪使用以下的PCR程序：
   1. 95 °彗星12分钟
   2. 95 °彗星30秒
   3. 60 ° C（或所需的退火温度）1分钟
   4. 72℃1分钟
   5. 2（× 13）
   6. 72 °彗星5分钟
   7. 10 °彗星∞
3. 超过Qiagen公司MinElute硅离心柱净化，根据制造商的指示反应。在50μL的EB缓冲液洗脱。该产品可现在使用的捕捉第二轮，开始在步骤2.1中，或直接进入454乳液PCR协议，进行测序。

代表性的成果：

强烈建议时与PEC协议开始执行第一个捕获反应与建议正常少量的阳性对照目标序列“（例如〜100bp的PCR产物 - 1皮克很容易不够）混合金额扩增454库模板（见第2.1步），并捕获与一个单一的PEC捕捉到的阳性对照产品设计引物进行。如果执行这种控制的反应是，qPCR的，既有积极的控制和454适配器特异性引物对可用于量化“控制目标”的量与纯化的引物延伸反应（1.3），引物延伸产品（ 2.3的背景）和洗脱磁珠捕获产品（3.6）。这样，无论是背景去除（“特殊性”），并在您的实验条件下的效率目标恢复（“敏感性”）的成效，可以直接测量。

一个成功的PEC协议通常具有以下属性 -

灵敏度（保留通过协议控制目标量测）：
的洗脱磁珠捕获产品的总量控制目标（3.6）=〜总额的 1-20％，在纯化的引物延伸反应（2.3）。

背景 （454 emPCR引物测）：
（3.6）洗脱磁珠捕获产品总额的背景<纯化的引物延伸反应（2.3）总额的 0.01 ％。

如果有小于1％的最终产品的剩余目标，引物延伸步骤可能已不成功，并且要追究。

如果有比0.01％的背景留在最终产品，洗涤步骤可能已被错误地执行，并应进行调查。

讨论

佩奇方法简单，快速，敏感性和特异性。因此，我们设想的作者的多个应用程序古代DNA外，如捕获的小分子RNA的RNA库的片段，审讯在样本或捕获16S（或其他位点）的多样性从宏基因组样品的结构变化。有一点要提的是，捕获灵敏度的PEC引物的多重捕获反应增加。因此，PEC是不是非常适合非常大（例如megabase或以上）的捕捉区域捕捉，但捕捉小目标的地区，许多人在快速时尚甚至SNP的立场是非常适合。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2	Applied Biosystems	N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
M-270 streptavidin beads	Invitrogen	653.05
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator	Invitrogen	120.02D