Primer Uzatma Yakalama: Ağır Bozulmuş DNA Kaynakları Hedefli Sıra Alma

Özet

Biz beş Neandertal bireylerin tam mitokondriyal genomların yeniden hedeflenen antik DNA dizisi alma, bir yöntem mevcut. Günümüze insanlar bu dizileri Karşılaştırma Neandertallerin uzun vadeli düşük etkili bir nüfus büyüklüğüne sahip olduğunu göstermektedir.

Özet

Biz, eski kemiklerin tipik olarak ağır bozulmuş ve mikrobiyal DNA ile kontamine DNA kaynaklardan hedeflenen DNA dizisi alma yöntemi mevcut. Bu yöntem, örnek yıkım ve PCR veya av tüfeği sıralama yaklaşımlar doğrudan göre sıralama talepleri büyük ölçüde azaltır. Biz coğrafi aralığında beş Neandertallerin mitokondriyal DNA (mtDNA) genomların yeniden oluşturmak için bu yöntem kullanılır. MtDNA geç Neandertallerin genetik çeşitlilik, çağdaş insanların daha yaklaşık üç kat daha düşük oldu. MtDNA protein evrim analizi ile birlikte, bu veriler Neandertallerin uzun vadeli etkin nüfus büyüklüğü, modern insan ve günümüze kadar gelen büyük maymunların daha küçük olduğunu öne sürmektedir.

Protokol

Bu yöntem bildirilen araştırmada kullanılan Briggs ve ark, Bilim 325 (5938). 318-321 (2009) .

Reaktifler gereklidir:

• AmpliTaq Gold DNA Polimeraz
• 10x GeneAmp PCR Buffer II
• MgCl ₂ 25mm
• dNTP karışımı, her biri 25 mM
• BSA, 10 mg ^ml-1 su
• Moleküler biyoloji sınıf su
• EB tamponu (MinElute PCR Arıtma kiti ile birlikte); 10 mM Tris HCl, pH 8.5
• MinElute PCR Arıtma Kiti
• M-270 streptavidin Dynabeads
• 2x Ciltleme ve Yıkama (BW) buffer (2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0,% 0.2 Tween 20)
• 1x Ciltleme ve Wash (BW) tampon (2x BindWash tampon su 2X seyreltilmiş)
• Sıcak Wash (HW) tamponu (2.5mm MgCl, 1X Taq Gold tampon,% 0.1 Tween 20)

Daha sonra standart olmayan reaktiflerin ve ekipmanlarla ilgili olarak üretici bilgi için tabloya bakınız.

1) Kütüphane amplifikasyon

1. Burada DNA örneğinin, 454 kütüphane düşük bir kopya sayısı DNA olarak açıklanan kaynak (Rohland ve Hofreiter, 2007a, 2007b) ve (Maricic ve Pääbo, 2009) hazırlanan bir. Bütün kütüphane yükseltmek için, aşağıdaki PCR karışımı hazırlayın:

   Reaktif	her reaksiyon için ul
   Su	45
   10X Gen Amp PCR tampon II.	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTP (her biri 25 mM)	1
   454 emPCR ileri primer/10uM	3
   454 emPCR rvs primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA polimeraz (5 U / ml)	1
   454 DNA kütüphane şablon	25
   Toplam	100

2. 14 döngüleri amplifikasyonu için bir Thermo cycler aşağıdaki PCR programı kullanın.
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C 30s
   3. 60 ° C (veya istenilen tavlama sıcaklığı) 1 dk.
   4. 72 ° C 1 dakika
   5. 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 ° C ∞
3. Üreticinin talimatlarına göre bir Qiagen MinElute spin kolon üzerinde reaksiyon arındırın. 50 ul tampon EB Zehir.
4. Saflaştırılmış amplifiye ürünün yanı sıra, qPCR (Meyer ve ark, 2007) ile Yükseltilmemiş kütüphane bir kısım sayısal olmalıdır. Amplifiye ürün ul başına en fazla 1 X 10 ¹² kopya varsa, en fazla 2 X 10 ¹² kopya Primer Extension reaksiyon olduğunu sağlamak için aşağıdaki Primer Eklenti adım şablon miktarını azaltmak.

2) Primer Uzantısı

1. Gerekli sayıda reaksiyon için bir ana karışımı hazırlayın.

   Reaktif	her reaksiyon için ul
   Su	45
   10X Gen Amp PCR tampon II.	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTP (her biri 25 mM)	1
   454 emPCR ileri primer/10uM	3
   454 emPCR rvs primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA polimeraz (5 U / ml)	1
   454 DNA kütüphane şablon	25
   Toplam	100

2. Tek astar uzatma reaksiyonu için bir termalcycler aşağıdaki programı çalıştırın:
   1. 95 ° C 12min
   2. 60 ° C (veya farklı ise PEC astar sıcaklığı tavlama) 1 dk
   3. 72 ° C'de 5 dakika
   4. 72 ° C sonsuza kadar!
      
      KRİTİK ADIM 72 ° C uzantısı sonra reaksiyon edin Bundan sonra direkt olarak ısı blok çıkarmadan önce tüpler içine QIAGEN MinElute arıtma için pipet 150ul PBI veya PB tampon. Bu non-spesifik astar tavlama önlemek ve karışım soğutur olarak yakalamak için önemlidir.
3. Üreticinin talimatlarına göre, bir Qiagen MinElute spin kolon üzerinde reaksiyon arındırın. 50 ul EB Zehir.

3) Uzatma Ürün Yakalama

1. M-270 boncuk vorteks tarafından süspanse edin stok solüsyonu. Örnek başına 25 ul boncuk süspansiyonu çıkartın. Örnek başına 25 ul 2xBW tampon, boncuklar 500ul 2x BW tampon ve tekrar süspansiyon ile iki kez yıkayın.
2. 25 ul eluat 2.3 adım adım 3.1 'den 25 ul boncuk süspansiyonu ekleyin. 1 döndürmek sonra karıştırın.Oda sıcaklığında 5 dakika.
   
   Önerilen: qPCR ölçümü için 2.3 adım 5 ul eluat kalan tutmak.
   
   
3. Taze bir 1.5ml tüp karışımın tamamı Transferi (hedef olmayan kütüphane parçalarının taşınmasını azaltmak için yardımcı olur). Pelet (PPK), Manyetik parçacık toplayıcı kullanarak süpernatant ve supernatant atın.
4. 500 ul 1xBW tampon (birçok yıkar, mümkün olduğu kadar çok arka plan olarak kaldırmak için yardımcı) ile 5 kez yıkayın. Son yıkama adımdan sonra, kısa bir süre aşağı spin ve süpernatant son izlerini kaldırmak.
5. 500μl 1x milyondan fazla Sıcak Yıkama (HW) tampon ekleyin. 2 dakika çalkalanır 65 ° C (veya yukarıda 5C PEC astar Tm) termal blok. Soğuma en aza indirmek için, bundan sonra hızlı bir şekilde süpernatantı. (Bu adım, hala PEC primerleri değil aslında uzantısı adım sırasında genişletilmiş ile ilişkili arka plan parçaları kaldırmak için). Süpernatant son izleri çıkarın.
6. 30 ul EB tampon boncuk pelletini tekrar. Taze bir 1.5ml tüp karışımın tamamı Transferi (hedef olmayan kütüphane parçalarının taşınmasını azaltmak için yardımcı olur). Yürütülmesi için bir termal cycler 3 dakika 95 ° C'de inkübe edin. PPK yerleştirin ve boncuklar geride bırakmak özen süpernatant kaldırmak.

4) Ürün Amplifikasyon Yakalama

1. Gerekli sayıda numune için PCR master miks hazırlayın.

   Reaktif	her reaksiyon için ul
   Su	45
   10X Gen Amp PCR tampon II.	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTP (her biri 25 mM)	1
   454 emPCR ileri primer/10uM	3
   454 emPCR rvs primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA polimeraz (5 U / ml)	1
   Yıkandı, yakalama ürün	25
   Toplam	100

2. Thermo cycler 14 döngüleri amplifikasyonu için aşağıdaki PCR programı kullanın:
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C 30s
   3. 60 ° C (veya istenilen tavlama sıcaklığı) 1 dk.
   4. 72 ° C 1 dakika
   5. 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 ° C ∞
3. Üreticinin talimatlarına göre bir Qiagen MinElute silika spin kolon üzerinde reaksiyon arındırın. 50 ul EB tampon Zehir. Ürün adım 2.1 başlayan veya sıralama 454 emülsiyon PCR protokolü, doğrudan girdi, ikinci bir tur için yakalama kullanarak.

Temsilcisi Sonuçlar:

Tavsiye edilen normal karışık bir 'pozitif kontrol hedef dizisinin' (1 pikogramdır kolaylıkla yeterli örneğin bir ~ 100bp PCR ürünü) küçük bir miktar önce bir yakalama reaksiyonu gerçekleştirmek için PEC protokolü ile başlatırken kuvvetle tavsiye miktarı (2.1 adım) 454 kütüphane şablon amplifiye ve yakalama pozitif kontrol ürünü yakalamak için tasarlanmış bir tek PEC astar ile yapılır. Hem kontrol özgü olumlu ve 454 adaptörü özgü primer çiftleri ile, bu kontrol reaksiyon yapılmazsa, qPCR saflaştırılmış astar uzatma reaksiyonu (1.3), astar uzatma ürünü (2.3 arka plan karşısında 'control hedef' miktarını ölçmek için kullanılan olabilir ) ve yıkandı, boncuk yakalama ürün (3.6). Bu şekilde, hem de etkinliğini deneysel koşullarda arka plan çıkarılması ("özgüllük") ve hedef kurtarma ("duyarlılık") verimliliği doğrudan ölçülebilir.

Başarılı bir PEC protokolü normalde şu özelliklere sahiptir -

Hassasiyet (protokol ile muhafaza kontrolü hedef miktarı ile ölçülen):
Yıkandı, boncuk yakalama ürün kontrolü hedefinin toplam miktarı (3.6) = ~ astar uzatma reaksiyonu (2.3) saflaştırılmış toplam miktarın% 1-20.

Background (454 emPCR primer çifti ile ölçülen):
Yıkandı, boncuk yakalama ürün (3.6), arka plan toplam tutarı (2.3) toplam miktarı% 0.01 .

Nihai ürünün hedef kalan% 1'inden daha azı varsa, astar uzantısı adım başarısız olabilir ve araştırılması gerekir.

Nihai ürün arka planda kalan% 0.01 daha fazla varsa, çamaşır adımları yanlış yapılmış olabilir ve araştırılması gerekir.

Tartışmalar

PEC yöntem, basit, hızlı, duyarlı ve özgül. Bu nedenle böyle bir RNA kütüphanesi küçük RNA parçaları yakalama, havuzlu bir örnek veya bir metagenomic örnek 16S (ya da diğer loci) çeşitliliği yakalama yapısal farklılıklar sorgulama olarak antik DNA dışında yazarların tasavvur birden çok uygulama,. Bahsetmek bir nokta yakalama duyarlılığı, çok katlı bir yakalama reaksiyon artar PEC primer sayı olarak daha düşük olur. PEC bu nedenle çok büyük (örneğin, bir megabase veya daha fazla) yakalama bölgelerin çekimi için ideal uygun değil, ama son derece iyi, hızlı bir şekilde birçok kişi küçük hedef bölgeler veya hatta SNP pozisyonları yakalamak için çok uygundur.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2	Applied Biosystems	N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
M-270 streptavidin beads	Invitrogen	653.05
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator	Invitrogen	120.02D