Primer captura Extensión: Secuencia de recuperación selectiva de las fuentes de ADN muy degradado

Resumen

Se presenta un método de recuperación de antiguos dirigidos secuencia de ADN, que se utiliza para reconstruir el genoma mitocondrial completo de cinco individuos neandertales. La comparación de estas secuencias con los seres humanos actuales sugieren que los neandertales tenían una baja capacidad a largo plazo efectivo de la población.

Resumen

Se presenta un método de recuperación dirigidos secuencia de ADN de fuentes de ADN que están muy degradados y contaminados con ADN microbiano, como es típico de huesos antiguos. El método reduce en gran medida la destrucción de la muestra y las demandas en relación con la secuenciación directa de PCR o métodos de secuenciación shotgun. Hemos utilizado este método para reconstruir la completa ADN mitocondrial (ADNmt) de los cinco genomas neandertales de toda su área geográfica. La diversidad genética mitocondrial de los neandertales tarde fue aproximadamente tres veces menor que la de los humanos modernos contemporáneos. Junto con el análisis de la evolución de proteínas ADN mitocondrial, estos datos sugieren que el tamaño de largo plazo efectivo de la población de neandertales era más pequeño que el de los humanos modernos y los grandes simios existentes.

Protocolo

Este método se utilizó en la investigación publicada en Briggs et al., Science 325 (5938). Trescientas dieciocho-trescientos veintiuno (2009) .

Reactivos necesarios:

• AmpliTaq Gold ADN polimerasa
• 10x GeneAmp PCR Buffer II
• _MgCl2 25 mM
• Mezcla de dNTP, 25 mM de cada uno
• BSA, 10 mg ^ml-1 en el agua
• Biología molecular de agua de grado
• EB tampón (suministrado con el kit de purificación MinElute PCR), 10 mM Tris-HCl, pH 8,5
• MinElute PCR kit de purificación
• M-270 streptavidina Dynabeads
• 2x encuadernación y lavado (BW) buffer (2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0, el 0,2% de Tween 20)
• 1x encuadernación y lavado (BW) buffer (buffer 2x BindWash diluido en agua 2 veces)
• Lave caliente (HW) buffer (2,5 mm de MgCl, Taq 1X buffer de oro, 0,1% Tween 20)

Para información del fabricante acerca de la no-estándar de reactivos y equipo de la tabla más adelante.

1) Biblioteca de amplificación

1. La plantilla de ADN que aquí hay una biblioteca de 454 preparados a partir de una fuente de copias de ADN de bajo número como se describe en (Rohland y Hofreiter, 2007a, 2007b) y (Maricic y Pääbo, 2009). Para ampliar la biblioteca de todo, preparar la siguiente mezcla de PCR:

   Reactivo	l por reacción
   De agua	45
   10X Gene Amp PCR buffer II	10
   MgCl 2 (25 mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mM cada uno)	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 vto emPCR primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold ADN polimerasa (5 U / l)	1
   454 plantilla de ADN de la biblioteca	25
   Total	100

2. Utilice el siguiente programa de PCR en un termociclador Thermo por 14 ciclos de amplificación
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C 30
   3. 60 ° C (temperatura deseada o recocido) 1 min
   4. 72 ° C 1 min
   5. Ir al 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5 minutos
   7. 10 ° C ∞
3. Purificar la reacción de más de una columna de centrifugación Qiagen MinElute de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Eluyen en 50 l EB buffer.
4. Cuantificar el producto purificado amplificados, así como una parte alícuota de la biblioteca sin amplificar con PCR cuantitativa (Meyer et al., 2007). Si el producto amplificado tiene más de 1 X 10 ¹² copias por ul, reducir la cantidad de plantilla en el paso de extensión del cebador siguiente para asegurar que no más de 2 X 10 ¹² ejemplares se añaden a la reacción de extensión de los iniciadores.

2) Primer Extensión

1. Prepare una mezcla maestra para el número requerido de las reacciones.

   Reactivo	l por reacción
   De agua	45
   10X Gene Amp PCR buffer II	10
   MgCl 2 (25 mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mM cada uno)	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 vto emPCR primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold ADN polimerasa (5 U / l)	1
   454 plantilla de ADN de la biblioteca	25
   Total	100

2. Aplicar el siguiente programa en un termociclador para la reacción de extensión del cebador único:
   1. 95 ° C 12min
   2. 60 ° C (o la imprimación PEC recocido temp si es diferente) 1 min
   3. 72 ° C 5 min
   4. 72 ° C para siempre!
      
      Paso crítico para mantener la reacción después de la extensión a 72 ° C. Luego directamente pipeta 150ul PBI o tampón PB de purificación QIAGEN MinElute en los tubos antes de sacarlo del bloque de calor. Esto es importante para evitar la no específica primer recocido y captura ya que la mezcla se enfríe.
3. Purificar la reacción de más de una columna de centrifugación Qiagen MinElute, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Eluyen en 50 l EB.

3) Extensión de la captura del producto

1. Resuspender solución madre de M-270 granos por agitación. Saque 25 l de suspensión de cuentas por muestra. Lave las cuentas dos veces con 500 ul 2x BW buffer y resuspender en 25 l de amortiguación 2xBW por muestra.
2. Añadir 25 l eluido a partir del paso desde 2,3 hasta 25 l de suspensión de cuentas desde el paso 3.1. Mezclar a continuación, gire de un5 min a temperatura ambiente.
   
   Recomendado: mantener restante 5 ul de que el efluente de la etapa 2.3 para la cuantificación de qPCR.
   
   
3. La transferencia de toda la mezcla a un tubo de 1,5 ml frescos (esto ayuda a reducir el arrastre de fragmentos de la biblioteca no objetivo). Pellet el sobrenadante con el colector de partículas magnéticas (MPC) y descartar el sobrenadante.
4. Lavar 5 veces con buffer de 500 l 1xBW (lavados ayudan a eliminar como telón de fondo tanto como sea posible). Después de la última etapa de lavado, centrifugar brevemente y eliminar los últimos restos de sobrenadante.
5. Agregar 500μl 1x Wash caliente (HW) de amortiguación. Agitar durante 2 min a 65 ° C (5C o por encima de la Tm PEC primer) en un bloque térmico. Eliminar el sobrenadante rápidamente después de esto, para minimizar el enfriamiento. (Este paso es para eliminar los fragmentos de fondo todavía se asocia con los primers PEC no, pero en realidad extendida durante la etapa de extensión). Eliminar los últimos restos de sobrenadante.
6. Resuspender el precipitado en 30 bolas buffer EB l. La transferencia de toda la mezcla a un tubo de 1,5 ml frescos (esto ayuda a reducir el arrastre de fragmentos de la biblioteca no objetivo). Se incuba a 95 ° C durante 3 minutos en un termociclador para la elución. Lugar en el MPC y eliminar el sobrenadante, teniendo cuidado de dejar las cuentas atrás.

4) La captura de amplificación de productos

1. Prepare una mezcla maestra de PCR para el número requerido de muestras.

   Reactivo	l por reacción
   De agua	45
   10X Gene Amp PCR buffer II	10
   MgCl 2 (25 mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mM cada uno)	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 vto emPCR primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold ADN polimerasa (5 U / l)	1
   Productos de captura eluye	25
   Total	100

2. Utilice el siguiente programa de PCR en un termociclador Thermo por 14 ciclos de amplificación:
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C 30
   3. 60 ° C (temperatura deseada o recocido) 1 min
   4. 72 ° C 1 min
   5. Ir al 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5 minutos
   7. 10 ° C ∞
3. Purificar la reacción sobre una columna Qiagen MinElute giro de sílice de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Eluyen en 50 tampón EB l. El producto puede ser ahora utilizado, ya sea para una segunda ronda de la captura, a partir del paso 2.1, o introducirse directamente en el protocolo 454 emulsión PCR, para la secuenciación.

Los resultados representativos:

Es muy recomendable cuando se inicia con el protocolo de PEC para llevar a cabo una primera reacción de captura en una pequeña cantidad de una "secuencia positiva objetivo de control (por ejemplo, a ~ 100 pb producto de PCR - un picogramo es bastante facilidad) se mezcla con la normal recomendado cantidad de amplificación 454 plantilla de la biblioteca (véase el paso 2.1), y la captura se realiza con una sola cartilla PEC diseñado para capturar el producto de control positivo. Si esta reacción se realiza el control, tanto positivas como qPCR con un control específico y 454 específica del adaptador de pares de cebadores se pueden utilizar para cuantificar la cantidad de "objetivo de control" frente a fondo en la reacción de extensión del cebador purificada (1,3), primer producto de extensión (2,3 ) y el producto se eluyó la captura de grano (3,6). De esta manera, tanto la eficacia de la eliminación del fondo (la "especificidad") y la eficiencia de recuperación de destino (la "sensibilidad") en sus condiciones experimentales se puede medir directamente.

El éxito de protocolo PEC normalmente tiene las siguientes propiedades -

Sensibilidad (medido por la cantidad de objetivo de control mantenido a través del protocolo):
Monto total de la meta de control de producto eluido captura de grano (3,6) = ~ 20.1% del total de purificar la reacción de extensión del cebador (2,3).

Fondo (medida por 454 el primer par emPCR):
Monto total del fondo en el producto eluido captura de grano (3,6) <0,01% del importe total en la reacción de extensión del cebador purificada (2,3).

Si hay menos de 1% de la meta que queda en el producto final, el paso de extensión del cebador puede haber tenido éxito y debe ser investigada.

Si no es mucho más que el 0,01% del fondo que queda en los productos finales, los pasos de lavado puede haber sido mal realizado y debe ser investigada.

Discusión

El método PEC es sencilla, rápida, sensible y específica. Por lo tanto, los autores prevén múltiples aplicaciones fuera de ADN antiguo, como la captura de pequeños fragmentos de ARN de una biblioteca de ARN, el interrogatorio de la variación estructural en una muestra colectiva o la captura de 16S (o loci otros) la diversidad de una muestra de metagenómica. Un punto a mencionar es que la sensibilidad de la captura se convierte en menor medida que el número de PEC cebadores en una reacción aumenta múltiple captura. PEC no es por tanto, ideal para la captura de las regiones de la captura de gran tamaño (por ejemplo, una megabase o más), pero está muy bien adaptado para la captura de las regiones objetivo pequeño o incluso posiciones de SNP de muchas personas de una manera rápida.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2	Applied Biosystems	N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
M-270 streptavidin beads	Invitrogen	653.05
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator	Invitrogen	120.02D