הארכת לכידת פריימר: אחזור רצף ממוקד ממקורות DNA מושפל בכבדות

Summary

אנו מציגים שיטה ממוקדת אחזור רצף ה-DNA העתיק, שבו השתמשנו לשחזר את הגנום המיטוכונדריאלי המלא של חמישה אנשים Neandertal. השוואה בין הרצפים עם בני האדם של ימינו מציע כי הניאנדרטלים היה ארוך טווח אפקטיבי נמוך גודל האוכלוסייה.

Abstract

אנו מציגים שיטה אחזור ממוקד רצף ה-DNA ממקורות DNA אשר מפורקים בכבדות מזוהמים עם ה-DNA של חיידקים, כמו אופייני עצמות עתיקות. השיטה מקטינה באופן משמעותי הרס מדגם ודרישות רצף ביחס ישיר PCR או רצף גישות רובה ציד. השתמשנו בשיטה זו כדי לשחזר את ה-DNA המיטוכונדרי מלא (mtDNA) הגנום של חמישה הניאנדרטלים מכל רחבי טווח הגיאוגרפי שלהם. המגוון הגנטי של mtDNA הניאנדרטלים המנוח היה כ שלוש פעמים נמוכה מזו של האדם המודרני העכשווי. יחד עם ניתוח של התפתחות חלבון mtDNA, נתונים אלה מראים כי גודל האוכלוסייה לטווח ארוך יעיל של הניאנדרטלים היה קטן יותר מזה של האדם המודרני ואת קופי הקיימים.

Protocol

בשיטה זו נעשה שימוש במחקר דיווחו בריגס et al. Science 325 (5938). 318-321 (2009) .

ריאגנטים הנדרש:

• AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA
• 10x GeneAmp PCR הצפת II
• MgCl ₂ 25mm
• dNTP לערבב, 25 מ"מ כל
• ארגון ה-BSA, 10 ^מ"ג-1 מ"ל מים
• מים מולקולרית ביולוגיה כיתה
• EB חיץ (המסופק עם ערכת טיהור MinElute PCR); 10 mM טריס HCl, pH 8.5
• MinElute PCR ערכת טיהור
• M-270 streptavidin Dynabeads
• 2x מחייב לכבס (BW) חוצץ (2 M NaCl, 10 mM טריס-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% Tween 20)
• 1x מחייב לכבס (BW) חוצץ (חיץ 2x BindWash 2X מדולל במים)
• חם לשטוף (HW) חוצץ (2.5mm MgCl, 1X תקי זהב חיץ, 0.1% Tween 20)

לפרטים היצרן לגבי שאינם סטנדרטיים ריאגנטים וציוד בהמשך הטבלה.

1) ספריית הגברה

1. תבנית ה-DNA כאן היא ספריית 454 שהוכן מקור ה-DNA נמוכה מספר עותק כמתואר (Rohland ו Hofreiter, 2007a, 2007b) ו (Maricic ו Pääbo, 2009). כדי להגביר את הספרייה כולה, להכין את תערובת ה-PCR הבאים:

   מגיב	μl לכל תגובה
   מים	45
   10X ג'ין Amp PCR חיץ II	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   ארגון ה-BSA (10 מ"ג / מ"ל)	2
   dNTPs (25 מ"מ כל אחד)	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 emPCR primer/10uM RVs	3
   AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA (5 U / μl)	1
   454 הספרייה תבנית ה-DNA	25
   סך הכל	100

2. השתמש בתוכנית הבאה PCR ב Cycler Thermo עבור הגברה מחזורים 14
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C ה -30
   3. 60 ° C (או זמני חישול הרצוי) 1 דקות
   4. 72 ° C 1 דקות
   5. עבור 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 ° C ∞
3. לטהר את התגובה על עמודה Qiagen ספין MinElute על פי הוראות היצרן. Elute ב EB 50 μl חיץ.
4. לכמת את המוצר מוגבר מטוהרים וכן aliquot הספרייה unamplified עם qPCR (Meyer et al. 2007). אם המוצר מוגבר יש יותר מ 1 X 10 ¹² עותקים ul, להפחית את כמות תבנית הצעד הבא תחל הרחבה על מנת להבטיח כי לא יותר מ 2 X 10 ¹² עותקים מתווספים התגובה הרחבה פריימר.

2) Primer Extension

1. הכינו תערובת אב נדרש מספר של תגובות.

   מגיב	μl לכל תגובה
   מים	45
   10X ג'ין Amp PCR חיץ II	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   ארגון ה-BSA (10 מ"ג / מ"ל)	2
   dNTPs (25 מ"מ כל אחד)	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 emPCR primer/10uM RVs	3
   AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA (5 U / μl)	1
   454 הספרייה תבנית ה-DNA	25
   סך הכל	100

2. הפעל את התוכנית הבאה Thermocycler עבור התגובה פריימר יחיד סיומת:
   1. 95 ° C 12min
   2. 60 ° C (או פריימר PEC שלך חישול זמני אם שונה) 1 דקות
   3. 72 ° C 5 דקות
   4. 72 ° C לנצח!
      
      שלב קריטי לשמור על התגובה לאחר הארכה על 72 ° C. ואז ישירות פיפטה 150ul PBI או PB חיץ לטיהור MinElute QIAGEN לתוך הצינורות לפני הסרת מהגוש החום. זה חשוב כדי למנוע הלא ספציפית פריימר חישול ללכוד כתערובת מתקררת.
3. לטהר את התגובה על עמודה ספין Qiagen MinElute, על פי הוראות היצרן. Elute ב EB 50 μl.

3) מוצר הרחבה לכידת

1. Resuspend פתרון המניות של M-270 חרוזים ידי vortexing. קח את 25 ההשעיה חרוז μl לדגימה. שטפו את החרוזים פעמיים עם 500ul 2x BW חיץ resuspend במאגר 2xBW 25 μl לדגימה.
2. הוסף 25 μl eluate משלב 2.3 להשעיית 25 חרוז μl משלב 3.1. מערבבים ולאחר מכן סובב עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   
   מומלץ: לשמור הנותרים 5 ul של eluate מן הצעד 2.3 עבור כימות qPCR.
   
   
3. מעבירים את התערובת כולה צינור 1.5ml טרי (זה עוזר להפחית שריד של יעד שאינם שברי ספריה). גלולה supernatant באמצעות אספן חלקיקים מגנטיים (MPC) וכן לבטל את supernatant.
4. לשטוף 5 פעמים עם חיץ 1xBW 500 μl (שוטף רבים לעזור להסיר את הרקע כמה שיותר). לאחר שלב הכביסה האחרונה, התפנית כלפי מטה בקצרה ולהסיר את שאריות supernatant.
5. הוסף 500μl 1x חם לשטוף (HW) חיץ. Shake דקות 2 ב 65 ° C (או 5C מעל פריימר PEC TM) על בלוק תרמי. הסר את supernatant מהר אחרי זה, כדי למזער להתקרר. (שלב זה היא להסיר קטעים הקשורים ברקע עדיין עם primers PEC אך לא הוארכה למעשה על שלב במהלך ההארכה). הסר את שאריות supernatant.
6. Resuspend גלולה חרוז במאגר 30 EB μl. מעבירים את התערובת כולה צינור 1.5ml טרי (זה עוזר להפחית שריד של יעד שאינם שברי ספריה). לדגור על 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות Cycler תרמית עבור elution. המקום של MPC ולהסיר את supernatant, מקפיד להשאיר את החרוזים מאחור.

4) לכידת הגברה מוצר

1. הכינו תערובת מאסטר PCR עבור מספר דגימות הנדרש.

   מגיב	μl לכל תגובה
   מים	45
   10X ג'ין Amp PCR חיץ II	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   ארגון ה-BSA (10 מ"ג / מ"ל)	2
   dNTPs (25 מ"מ כל אחד)	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 emPCR primer/10uM RVs	3
   AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA (5 U / μl)	1
   ללכוד eluted המוצר	25
   סך הכל	100

2. השתמש בתוכנית הבאה PCR ב Cycler Thermo עבור הגברה 14 מחזורים:
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C ה -30
   3. 60 ° C (או זמני חישול הרצוי) 1 דקות
   4. 72 ° C 1 דקות
   5. עבור 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 ° C ∞
3. לטהר את התגובה על טור MinElute Qiagen ספין סיליקה על פי הוראות היצרן. Elute במאגר 50 EB μl. המוצר יכול לשמש גם עכשיו לסיבוב השני של ללכוד, החל שלב 2.1, או נכנס ישירות לתוך 454 תחליב PCR פרוטוקול, עבור סידור.

נציג תוצאות:

מומלץ מאוד כאשר מתחיל עם פרוטוקול PEC לבצע התגובה הראשונה ללכוד בו כמות קטנה של "רצף מטרה חיובית שליטה" (לדוגמה ~ 100bp מוצר PCR - 1 picogram די בקלות) מעורבב עם הרגיל מומלץ כמות מוגברת 454 תבנית הספרייה (ראה שלב 2.1), ו ללכוד מתבצע עם פריימר PEC אחת שנועדה ללכוד את המוצר בקרה חיובית. אם זו התגובה השליטה מתבצעת, qPCR עם שני חיובית שליטה ספציפיים ספציפי מתאם 454 זוגות פריימר ניתן לכמת את כמות "המטרה לשלוט" לעומת רקע התגובה מטוהרים פריימר הארכה (1.3), הרחבה המוצר פריימר (2.3 ) וללכוד eluted מוצר חרוז (3.6). בדרך זו, הן האפקטיביות של הסרת רקע ("סגוליות") וכן את היעילות של התאוששות היעד ("רגישות") בתנאי הניסוי שלך ניתן למדוד ישירות.

מוצלח PEC פרוטוקול בדרך כלל יש את המאפיינים הבאים -

רגישות (נמדד על ידי כמות היעד השליטה נשמרת באמצעות פרוטוקול):
סך מטרה לשלוט במוצר eluted ללכוד חרוז (3.6) = ~ 10-20% מהסכום הכולל מטוהרים הארכת תחל תגובה (2.3).

רקע (נמדד על ידי זוג 454 תחל emPCR):
סך רקע במוצר eluted ללכוד חרוז (3.6) <0.01% מהסכום הכולל בתגובה מטוהרים פריימר הארכה (2.3).

אם יש פחות מ -1% של יעד שנותרו המוצר הסופי, הצעד הרחבה פריימר יכול להיות מוצלח וצריכים להיחקר.

אם יש הרבה יותר מאשר 0.01% על רקע שנותרו המוצרים הסופיים, צעדים הכביסה יכול להיות מבוצע בצורה לא נכונה ויש לחקור.

Discussion

השיטה PEC היא פשוטה, מהירה, רגיש וספציפי. לכן אנו חוזים כותבי יישומים מרובים מחוץ DNA עתיק, כמו לכידת קטן שברי RNA מספריית RNA, חקירה של וריאציה מבניים מדגם ונקווה או לכידתו של 16S (לוקוסים או אחרים) גיוון ממדגם metagenomic. נקודה אחת להזכיר כי הרגישות של ללכוד הופך להיות נמוך יותר ככל שמספר PEC primers ב ללכוד מגדילה זמנית התגובה. PEC ולכן הוא לא אידיאלי עבור לכידת האזורים ללכוד גדול מאוד (למשל megabase או יותר), אך הוא מתאים מאוד גם עבור לכידת האזורים היעד קטן או אפילו עמדות SNP מאנשים רבים באופן מהיר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2	Applied Biosystems	N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
M-270 streptavidin beads	Invitrogen	653.05
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator	Invitrogen	120.02D