プライマー伸長キャプチャ：重縮退DNAソースからターゲットシーケンスの取得

要約

我々は、我々は5つのネアンデルタール人の完全なミトコンドリアゲノムを再構築するために使用されるターゲット古代のDNA配列の検索、の方法を提示する。現代の人間とのこれらの配列の比較は、ネアンデルタール人は、長期の低効果的な人口の大きさを持っていたことを示唆している。

要約

古代の骨の典型的なように我々は、大きく劣化し、微生物のDNAで汚染されているDNAの源から標的DNA配列の取得の方法を提示する。方法は、大幅にPCRまたはショットガンシーケンシングのアプローチを指示するために相対的なサンプルの破壊とシーケンシング要求を減少させる。我々は、地理的範囲にわたってから五ネアンデルタール人の完全なミトコンドリアDNA（mtDNA）のゲノムを再構成するためにこのメソッドを使用する。後期ネアンデルタール人のミトコンドリアDNAの遺伝的多様性は、現代的な現代人のそれよりも約3倍低かった。一緒にミトコンドリアのタンパク質の進化の分析と、これらのデータは、ネアンデルタール人の長期的効果的な集団サイズが現代人と現存の大型類人猿のそれより小さかったことを示唆している。

プロトコル

このメソッドは、で報告された研究で使用されてブリッグスら、Science 325（5938）。 318〜321（2009） 。

必要な試薬：

• のAmpliTaqゴールドDNAポリメラーゼ
• 10倍ジーンアンプPCRバッファーII
• MgCl _2の 25mMの
• dNTPミックス、25mMの各
• BSA、10 mgの水のML - ¹
• 分子生物学グレードの水
• EBバッファ（アプライPCR精製キットに付属）、10mMのトリスHCl、pH8.5で
• アプライPCR精製キット
• M - 270ストレプトアビジンのDynabeads
• 2倍のバインドとウォッシュ（BW）バッファー（2 M NaCl、10mMのトリス- Cl、1mMのEDTA、pH8.0の0.2％ツイーン20）
• 1Xバインディングとウォッシュ（BW）バッファー（2 × BindWashのバッファ水で2倍希釈）
• ホットウォッシュ（HW）バッファ（2.5mmの塩化マグネシウム、1 × Taqポリメラーゼゴールドバッファー、0.1％のTween 20）

非標準試薬と機器に関するメーカーの情報については、後でテーブルを参照してください。

1）図書館の増幅

1. ここにDNA鋳型は454で説明されているように、低コピー数のDNAの源から調製したライブラリ（RohlandとHofreiter、2007A、2007B）と（MaricicとPääbo、2009）である。ライブラリ全体を増幅するために、以下のPCRミックスを調製：

   試薬	反応あたりμL
   水	45
   10XジーンアンプPCR緩衝液II	10
   のMgCl 2（25mMの）	10
   BSA（10 mg / ml）を	2
   のdNTP（25mMの各）	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 emPCRのRV車のprimer/10uM	3
   のAmpliTaqゴールドのDNAポリメラーゼ（5 U /μL）	1
   454 DNAライブラリーのテンプレート	25
   合計	100

2. 14サイクルの増幅のためのサーモサイクラーに以下のPCRプログラムを使用して、
   1. 95℃12分
   2. 95℃30秒
   3. 60 ° C（または、目的のアニーリング温度）1分
   4. 72℃1分
   5. 2（× 13）に移動します
   6. 72℃5分
   7. 10 ° C∞
3. 製造元の指示に従ってキアゲンMinEluteスピンカラム上の反応を清める。 50μlのバッファーのEBで溶出します。
4. 精製された増幅産物だけでなく、定量PCRで増幅されていないライブラリのアリコート（Meyerら、2007）定量化する。増幅産物は、ULあたり以上1 × 10 ^12個のコピーを持っている場合ではなく、2つ以上のX 10 ¹²コピーは、プライマー伸長反応に追加されるように以下のプライマー伸長のステップでテンプレートの量を減らす。

2）プライマー伸長

1. 反応の必要な数のマスターミックスを調製する。

   試薬	反応あたりμL
   水	45
   10XジーンアンプPCR緩衝液II	10
   のMgCl 2（25mMの）	10
   BSA（10 mg / ml）を	2
   のdNTP（25mMの各）	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 emPCRのRV車のprimer/10uM	3
   のAmpliTaqゴールドのDNAポリメラーゼ（5 U /μL）	1
   454 DNAライブラリーのテンプレート	25
   合計	100

2. 単一のプライマー伸長反応のためのサーモで次のプログラムを実行します。
   1. 95℃12分
   2. 60 ° C（または、PECのプライマーのアニーリング温度と異なる場合）1分
   3. 72℃5分
   4. 72 ° C永遠に！
      
      重要なステップは、72で拡張後の反応℃以下でご使用ください。ヒートブロックから削除する前に、チューブにQIAGENアプライの​​精製のため、直接ピペット150ul PBIまたはPBバッファ。これは、アニーリング非特異的プライマーを避けるために、混合物は冷却としてキャプチャすることが重要です。
3. 製造元の指示に従って、キアゲンMinEluteスピンカラム上に反応して浄化する。 50μlのEBで溶出。

3）拡張製品のキャプチャ

1. ボルテックスによりM - 270ビーズの再懸濁し、ストック溶液。サンプルあたり25μlのビーズ懸濁液を取り出してください。サンプルあたり25μlの2xBWバッファに500ul 2倍BWバッファーに懸濁するで二回ビーズを洗浄してください。
2. ステップ3.1からステップ2.3から25μlのビーズ懸濁液に25μlの溶出液を追加。 1に対して回転して混ぜる室温で5分。
   
   推奨 ：定量PCRの定量化のためのステップ2.3からの溶出液の5μlの残り続ける。
   
   
3. 新鮮な1.5mlチューブに混合物全体を転送する（これは、非ターゲットライブラリのフラグメントのキャリーオーバーを減らすのに役立ちます）。ペレット磁気粒子のコレクタ（MPC）を用いて上清、上清を捨てる。
4. 500μlの1xBWバッファー（多くの洗浄はできるだけ多くのバックグラウンドとして除去するのに役立つ）で5回洗浄する。最後の洗浄ステップの後、一時的にスピンダウンし、上清の最後の痕跡を削除する。
5. 500μL× 1ホットウォッシュ（HW）バッファを追加します。サーマルブロックに65 ° C（またはPECプライマーのTm上記5C）で2分間振とうする。冷却最小限に抑えるために、この後すぐに上清を取り除く。 （このステップはまだPECプライマーではなく、実際に延長工程の間に延長に関連付けられている背景の断片を削除することです）。上清の最後の痕跡を削除します。
6. 30μlのEBバッファにビーズペレットを再懸濁する。新鮮な1.5mlチューブに混合物全体を転送する（これは、非ターゲットライブラリのフラグメントのキャリーオーバーを減らすのに役立ちます）。溶出用サーマルサイクラーで3分間95℃でインキュベートする。 MPCの場所と背後にあるビーズを残すように注意しながら、上清を取り除く。

4）製品の増幅をキャプチャ

1. サンプルの必要な数のPCRマスターミックスを調製する。

   試薬	反応あたりμL
   水	45
   10XジーンアンプPCR緩衝液II	10
   のMgCl 2（25mMの）	10
   BSA（10 mg / ml）を	2
   のdNTP（25mMの各）	1
   454 emPCR FWD primer/10uM	3
   454 emPCRのRV車のprimer/10uM	3
   のAmpliTaqゴールドのDNAポリメラーゼ（5 U /μL）	1
   溶出されたキャプチャ製品	25
   合計	100

2. 14サイクルの増幅のためにサーモサイクラーでは、次のPCRプログラムを使用します。
   1. 95℃12分
   2. 95℃30秒
   3. 60 ° C（または、目的のアニーリング温度）1分
   4. 72℃1分
   5. 2（× 13）に移動します
   6. 72℃5分
   7. 10 ° C∞
3. 製造元の指示に従ってキアゲンアプライシリカスピンカラムを介して反応を清める。 50μlのEBのバッファーで溶出。製品はステップ2.1で始まる、キャプチャの第二ラウンドのいずれかを使用、または順序付けのために、454エマルジョンPCRのプロトコルに直接入力できます。

代表的な結果：

推奨ノーマルと混在さ - "陽性対照標的配列"（1ピコグラムは、簡単に十分な例：a〜100ベーシスポイントPCR産物）の少量が最初に捕獲反応を行うためにPECのプロトコルを使い始めたときにそれを強くお勧めします。増幅された454ライブラリのテンプレート（ステップ2.1参照）の量、およびキャプチャはポジティブコントロールの製品をキャプチャするために設計された単一のPECのプライマーを使用して実行されます。このコントロール反応が行われる場合、ポジティブコントロール固有の、454アダプタ固有のプライマーペアの両方の定量PCRは、精製したプライマー伸長反応（1.3）で"制御対象"対バックグラウンドの量を定量することができる、プライマー伸長生成物（2.3 ）と溶出ビーズキャプチャ製品（3.6）。この方法では、あなたの実験条件におけるバックグラウンドの除去（"特異性"）とターゲットの回復（"感度"）の効率性の両方の効果を直接測定することができます。

成功したPECプロト​​コルは、通常、次のプロパティがあります -

感度（プロトコルを介して保持された制御対象の量によって測定される）：
溶出ビーズキャプチャ製品で制御対象の合計金額（3.6）=〜プライマー伸長反応（2.3）精製における総量1〜20％。

背景 （454 emPCRのプライマー対によって測定される）：
溶出ビーズキャプチャ製品（3.6）で背景の総量<精製したプライマー伸長反応（2.3）の合計額の0.01％。

最終製品に残っているターゲットの1％未満がある場合は、プライマー伸長のステップは失敗している可能性があり、調査する必要があります。

最終製品に残っている背景の0.01％よりもはるかにある場合は、洗浄ステップが正しく実行された可能性があり、調査する必要があります。

ディスカッション

PECの方法は、簡単、迅速、高感度かつ特異的である。したがって、我々は、著者などのRNAライブラリから小さなRNA断片のキャプチャのような古代のDNAの外側に描く、複数のアプリケーション、メタゲノムサンプルからプールされたサンプルや16Sのキャプチャ（または他の遺伝子座）多様性の構造変化の尋問。言及する一つのポイントは、キャプチャの感度は、多重捕獲反応が増加するのPECプライマーの数として低くなるということです。 PECは、したがって、理想的に（例えばメガベース以上）非常に大規模な捕獲領域のキャプチャには適していない、しかし非常によく迅速な方法で多くの個人から小規模なターゲット領域、あるいはSNP位置の捕獲に適しています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2	Applied Biosystems	N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
M-270 streptavidin beads	Invitrogen	653.05
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator	Invitrogen	120.02D