Primer Extension Capture: Gezielte Sequence Retrieval von stark degradierte DNA Sources

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Methode zur gezielten alten DNA-Sequenz Abruf, die wir benutzt, um die komplette mitochondriale Genom von fünf Neandertal Individuen zu rekonstruieren. Der Vergleich dieser Sequenzen mit den heutigen Menschen nahe, dass Neandertaler eine langfristige geringe effektive Populationsgröße hatte.

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Methode zur gezielten DNA-Sequenz Abruf von DNA-Quellen, die stark degradiert und kontaminiert mit mikrobiellen DNA sind, wie es typisch für alte Knochen. Die Methode reduziert Probe Zerstörung und Sequenzierung Anforderungen in Bezug auf PCR oder Shotgun-Sequenzierung Ansätze zu lenken. Wir nutzten diese Methode, um die komplette mitochondriale DNA (mtDNA) Genome von fünf Neandertalern aus über ihre geographische Reichweite zu rekonstruieren. Die mtDNA der genetischen Vielfalt der späten Neandertaler war etwa dreimal geringer als die der heutigen modernen Menschen. Zusammen mit den Analysen der mtDNA Evolution von Proteinen, deuten diese Daten, dass die langfristige effektive Populationsgröße von Neandertalern kleiner als die des modernen Menschen und vorhandenen Menschenaffen wurde.

Protokoll

Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet Briggs et al., Science 325 (5938). 318-321 (2009) .

Reagenzien benötigt:

• AmpliTaq Gold DNA Polymerase
• 10x GeneAmp PCR Buffer II
• MgCl ₂ 25mM
• dNTP-Mix, 25 mM jedes
• BSA, 10 mg ^ml-1 in Wasser
• Molekulare Biologie-grade Wasser
• EB-Puffer (im Lieferumfang MinElute PCR Purification Kit), 10 mM Tris HCl, pH 8,5
• MinElute PCR Purification Kit
• M-270 Streptavidin Dynabeads
• 2x Binding und Wash (BW)-Puffer (2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,2% Tween 20)
• 1x Binding und Wash (BW)-Puffer (2x BindWash verdünnt 2X in Wasser)
• Hot Wash (HW)-Puffer (2,5 mm MgCl, 1X Taq Gold-Puffer, 0,1% Tween 20)

Für Hersteller Informationen über die Nicht-Standard-Reagenzien und Geräte siehe unten Tabelle.

1) Bücherei Verstärkung

1. Die DNA-Template hier ist ein 454-Bibliothek aus einer geringen Anzahl von Kopien DNA-Quelle wie in (Rohland und Hofreiter, 2007a, 2007b) und (Maricic und Pääbo, 2009) vorbereitet. Zur Verstärkung der gesamten Bibliothek, bereiten Sie das folgende PCR-Mix:

   Reagens	ul pro Reaktion
   Wasser	45
   10X Gene Amp PCR-Puffer II	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mM)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR rvs primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5 U / ul)	1
   454 DNA-Bibliothek Vorlage	25
   Gesamt	100

2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Programm in einem Thermo-Cycler für 14 Zyklen Amplifikation
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C 30s
   3. 60 ° C (oder gewünschte Glühen Temp) 1 min
   4. 72 ° C 1 min
   5. Zum 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 ° C ∞
3. Purify die Reaktion über eine Qiagen MinElute Spin-Säule nach den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 50 ul Puffer EB.
4. Quantifizierung der gereinigten Amplifikat sowie ein Aliquot des unverstärkten Bibliothek mit qPCR (Meyer et al., 2007). Wenn das amplifizierte Produkt verfügt über mehr als 1 X 10 ¹² Kopien pro ul, reduzieren die Menge an Template in der folgenden Primer Extension Schritt, um sicherzustellen, dass nicht mehr als 2 X 10 ¹² Exemplare an die Primerverlängerungsreaktion hinzugefügt werden.

2) Primer Extension

1. Bereiten Sie einen Master-Mix für die erforderliche Anzahl von Reaktionen.

   Reagens	ul pro Reaktion
   Wasser	45
   10X Gene Amp PCR-Puffer II	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mM)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR rvs primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5 U / ul)	1
   454 DNA-Bibliothek Vorlage	25
   Gesamt	100

2. Führen Sie das folgende Programm in einem Thermocycler für die einzelnen Primer-Extension-Reaktion:
   1. 95 ° C 12min
   2. 60 ° C (oder Ihr PEC Primeranlagerung Temp. falls abweichend) 1 min
   3. 72 ° C 5 min
   4. 72 ° C für immer!
      
      Entscheidender Schritt halten Reaktion nach Verlängerung bei 72 ° C. Dann direkt Pipette 150ul PBI oder PB-Puffer für QIAGEN MinElute Reinigung in die Rohre vor dem Entfernen von der Hitze zu blockieren. Dies ist wichtig, um nicht-spezifische Primer zu vermeiden Glühen und erfassen, wie die Mischung abgekühlt ist.
3. Purify die Reaktion über eine Qiagen MinElute Spin-Säule, nach den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 50 ul EB.

3) Erweiterung Produkt Erfassen

1. Resuspendieren Stammlösung von M-270 Perlen durch Vortexen. Nehmen Sie 25 ul Bead-Suspension pro Probe. Waschen Sie die Kugeln zweimal mit 500 ul 2x BW-Puffer resuspendieren und in 25 ul 2xBW Puffer pro Probe.
2. Add 25 ul Eluat aus Schritt von 2,3 bis 25 ul Bead-Suspension aus Schritt 3.1. Mix dann für 1 drehen5 min bei Raumtemperatur.
   
   Empfohlen: halten restlichen 5 ul des Eluats aus Schritt 2.3 für qPCR Quantifizierung.
   
   
3. Übertragen Sie die gesamte Mischung in ein frisches 1,5 ml Röhrchen (dies hilft, Verschleppung von Nicht-Ziel-Bibliothek Fragmente zu reduzieren). Pellet der Überstand mit der Magnetpulverprüfung Kollektor (MPC) und den Überstand verwerfen.
4. Wash 5-mal mit 500 ul 1xBW Puffer (vielen Wäschen helfen, so viele Hintergrundinformationen wie möglich zu entfernen). Nach dem letzten Waschschritt Spin-Down kurz und entfernen die letzten Spuren der Überstand.
5. Fügen Sie 500μl 1x Hot Wash (HW) Puffer. Schütteln für 2 min bei 65 ° C (oder 5C oberhalb des PEC Primer Tm) auf einem thermischen Block. Entfernen Sie den Überstand schnell danach zu minimieren Abkühlung. (Dieser Schritt ist in den Hintergrund Fragmente noch mit dem PEC-Primer, aber nicht tatsächlich während der Verlängerung Schritt erweitert damit verbundenen entfernen). Entfernen Sie die letzten Spuren der Überstand.
6. Resuspendieren bead Pellet in 30 ul EB-Puffer. Übertragen Sie die gesamte Mischung in ein frisches 1,5 ml Röhrchen (dies hilft, Verschleppung von Nicht-Ziel-Bibliothek Fragmente zu reduzieren). Inkubation bei 95 ° C für 3 Minuten in einem Thermocycler für die Elution. Legen Sie in den MPC und den Überstand, kümmert sich um die Perlen zu hinterlassen.

4) Capture Produkt Amplification

1. Bereiten Sie ein PCR Master Mix für die erforderliche Anzahl von Proben.

   Reagens	ul pro Reaktion
   Wasser	45
   10X Gene Amp PCR-Puffer II	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mM)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR rvs primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5 U / ul)	1
   Eluiert Capture Produkt	25
   Gesamt	100

2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Programm in einem Thermo-Cycler für 14 Zyklen Amplifikation:
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C 30s
   3. 60 ° C (oder gewünschte Glühen Temp) 1 min
   4. 72 ° C 1 min
   5. Zum 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 ° C ∞
3. Purify die Reaktion über eine Qiagen MinElute Silica-Spin-Säule nach den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 50 ul EB-Puffer. Das Produkt kann nun entweder für eine zweite Runde zu erfassen, beginnend bei Schritt 2.1, eingegeben oder direkt in der 454-Emulsions-PCR-Protokoll für die Sequenzierung.

Repräsentative Ergebnisse:

Es wird dringend empfohlen, wenn beginnend mit dem PEC-Protokoll, um zunächst eine Abfangreaktion, wo eine kleine Menge eines "positiven Kontrolle Zielsequenz" (zB ~ 100bp PCR-Produkt - 1 Picogramm ist leicht genug) führen in ist mit dem normalen empfohlen gemischt Höhe von 454 verstärkt Bibliothek Vorlage (siehe Schritt 2.1), und fangen mit einer einzigen PEC Primer entwickelt, um die positive Kontrolle Produkt erfassen durchgeführt. Wenn diese Kontroll-Reaktion durchgeführt wird, qPCR mit sowohl positiven als steuerungs-und 454-Adapter-spezifischen Primer-Paare können verwendet werden, um die Menge der 'control Ziel' versus Hintergrund in das gereinigte Primerverlängerungsreaktion (1,3), Primer Extension Produkt (2,3 quantifizieren ) und eluiert bead Capture Produkt (3,6). Auf diese Weise können sowohl die Wirksamkeit der Hintergrund entfernen ("Spezifität") und die Effizienz der Zielwiederherstellungspunkt ("Sensibilität") in Ihrem experimentellen Bedingungen direkt gemessen werden.

Eine erfolgreiche PEC-Protokoll in der Regel hat die folgenden Eigenschaften -

Empfindlichkeit (gemessen Maß an Kontrolle über die Ziel-Protokoll erhalten):
Gesamtbetrag der Kontrolle Ziel in eluiert bead Capture Produkt (3,6) = ~ 1-20% der Gesamtmenge in gereinigtem Primerverlängerungsreaktion (2,3).

Background (gemessen von 454 emPCR Primerpaar):
Gesamtbetrag der Hintergrund in eluiert bead Capture Produkt (3,6) <0,01% der Gesamtmenge in gereinigtem Primerverlängerungsreaktion (2,3).

Wenn es weniger als 1% der Zielgruppe noch in der endgültigen Produkt kann die Primer-Extension-Schritt nicht erfolgreich gewesen und sollten untersucht werden.

Wenn es viel mehr als 0,01% der Hintergrund noch in der endgültigen Produkten kann der Waschschritte wurde falsch durchgeführt haben und sollten untersucht werden.

Diskussion

Die PEC-Methode ist einfach, schnell, sensitiv und spezifisch. Deshalb haben wir die Autoren vorstellen, mehrere Anwendungen außerhalb der alten DNA, wie Erfassung von kleinen RNA-Fragmente aus einer RNA-Bibliothek, der Vernehmung von strukturellen Variation in einer Sammelprobe oder Fangen von 16S (oder andere loci) Vielfalt aus einer metagenomische Probe. Ein Punkt zu erwähnen ist, dass die Sensitivität der Erfassung niedriger als die Zahl der PEC-Primer in einer Multiplex-Capture-Reaktion erhöht wird. PEC ist daher nicht ideal für die Erfassung von sehr großen (zB ein Megabasen oder mehr) zu erfassen Regionen geeignet, sondern ist sehr gut für die Erfassung von kleinen Zielregionen oder sogar SNP-Positionen aus vielen Individuen in einer schnellen Weise geeignet.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2	Applied Biosystems	N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
M-270 streptavidin beads	Invitrogen	653.05
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator	Invitrogen	120.02D