استهداف المنشآت الدماغ العميق مع Microinjections لتسليم المخدرات وناقلات فيروسية ، أو زرع الخلايا

Summary

في هذه المقالة ، وتبين لنا طريقة لجعل الإبر الزجاج الشعرية مع التجويف 50 ميكرومتر. هذا الأسلوب يقلل بشكل ملحوظ من تلف في الدماغ ويقلل من انتشار السلبية للمخدرات ويسمح باستهداف دقيق في الدماغ القوارض.

Abstract

Microinjections في لحمة الدماغ هي الاجراءات الهامة لتسليم المخدرات ، وناقلات فيروسية أو زرع الخلايا. آفة الدماغ التي تنتج إبرة حقن خلال مساره هو مصدر قلق كبير خصوصا في مخ الفأر ليست فقط في الدماغ هو صغير ولكن أيضا في بعض الأحيان هناك حاجة لحقن متعددة. نعرض هنا طريقة لإنتاج الزجاج الإبر الشعرية مع التجويف 50 ميكرون مما يقلل بشكل كبير من تلف في الدماغ ويسمح لاستهداف دقيقة في الدماغ القوارض. هذا الأسلوب يسمح للتسليم كميات صغيرة (2-10 NL) ، ويقلل من مخاطر النزيف ، ويقلل من انتشار المخدرات السلبي في لحمة الدماغ. باستخدام مختلفة الحجم من أنابيب الزجاج الشعرية ، أو تغيير تجويف الإبرة ، يمكن حقنه عدة أنواع من المواد والخلايا. Microinjections مع أنبوب زجاجي الشعرية تمثل تحسنا كبيرا في تقنيات الحقن العميق للمخ واستهداف مع الحد الأدنى من الأضرار الجانبية في القوارض الصغيرة.

Protocol

1. جعل الإبر الزجاج قبل الجراحة الماوس :
   1. وضع أنبوب زجاجي الشعرية في مجتذب micropipette.
   2. الحرارة منتصف أنبوب زجاجي لتليين أنبوب زجاجي في منطقة المترجمة.
   3. تمديد أنبوب زجاجي على طول محورها الطولي من قبل مسافة كافية للتسبب الأولية انخفاضا في قطر أنبوب زجاجي في منطقة المترجمة.
   4. إبقاء تمتد أنبوب زجاجي حتى ينكسر. بهذه الطريقة ، يتم الحصول على متطابقتين الإبر واحد للبرميل.
2. وضع الإبرة الزجاج في microforge. زاوية 30 درجة تكفي لشطبة غيض.
3. الاختيار تحت المجهر أن كل إبرة والقطر الداخلي الصحيح. بالنسبة لمعظم العقاقير ماء قطرها ميكرون 30-50 الداخلية مثالية (الشكل 1).
4. تملأ الإبرة مع الزيوت المعدنية من أوسع نهاية الإبرة الزجاج. اسمحوا ان الزيوت المعدنية (MSDS ، القط. M7700) يدخل من الشعرية حتى تصل ~ 50 ٪ من طول الأنبوب الشعرية. وضعت عالية فراغ الشحوم (داو كورننغ ، القط. AB - 05054) حول المكبس لختم أوسع نهاية الإبرة.
5. إدراج بواسطة المكبس أوسع نهاية الإبرة المعدنية ودفع النفط برفق حتى ينظر إلى قطرة صغيرة من زيت الخروج من رأس الإبرة الزجاج.
6. تأمين الزجاج في إبرة صاحب microinjector.
7. تخدير الفأر مع آفيرتين 2.5 ٪ (2،2،2 - ثلاثي بروم إيثانول + كحول أميلي ثالثي ، 01:01 ث / ت). جرعة من 25 غرام 30μL في داخل الصفاق.
8. وضع وسادة التدفئة على الجهاز للحفاظ على درجة حرارة المجسم الحيوان الجسم عند 37 درجة مئوية.
9. مكان آمن ورئيس جهاز الماوس في المجسم باستخدام قضبان الأذن وحامل الأسنان.
10. تنظيف رأس الفأر مع 0.1 ٪ كلورهكسيدين غلوكونات الحل ، تليها الايثانول 70 ٪ و 0.1 ٪ جلوكونات الكلورهيكسيدين للمرة الثانية.
11. شق الجلد مع شفرة جراحية # 15 من آذان الفأر إلى خط الجمجمة لامبا.
12. تلميع الجمجمة مع القطن المبادلة لتجف بها وسحب الجلد خارج الحقل الجراحية.
13. استخدام غيض من الزجاج لإبرة نقطة في قمة الرأس للخياطة Bregma. يوجد لديك لضبط الموقف المبدئي من حاقن (في تنسيق "صفر").
14. تعيين نقطة لحفر عن طريق تحريك "X" و "Y" محور الجهاز المجسم على الجمجمة.
15. حفر ثقوب دقيقة جدا في التنسيق المحدد. وقد سبق تعقيم الأدوات المعدنية وMicrodrills أخرى عند 250 درجة مئوية لمدة 60 ثانية مع حبة تعقيم الزجاج الجافة (كول بالمر ، القط. EW - رقم 10779-00).
16. ملقط مع غرامة إزالة بعناية أعمق طبقة من العظام وكسر الغشاء duramatter (سوف نرى بعض السائل الدماغي الشوكي تسرب).
17. تأكد من أن الإبرة يمكن أن تذهب من خلال الثقوب المحفورة.
18. 1 ميكرولتر ماصة للدواء الذي تريد حقن ووضعها على قطعة صغيرة من parafilm.
19. وضع parafilm على الجمجمة.
20. امتصاص الدواء من خلال الدوران على العجلات microinjector ، في حين كنت الاختيار تحت المجهر أن السائل هو الصعود إلى الإبرة الزجاج.
21. إزالة parafilm وإعادة تعيين تنسيق صفر.
22. تحرك الإبرة إلى إحداثيات المحدد ، أسفل حامل حتى غيض من الزجاج إبرة اللمس برفق على سطح الدماغ ، وتعيين "Z" تنسيق في صفر.
23. إدخال الإبرة في الزجاج لحمة على عمق الدماغ المحدد.
24. حقن الدواء ببطء بمعدل NL 1 ~ / ثانية.
25. عندما يتم حقن حجم الرغبة ، والسماح للنشر المخدرات في لحمة لمدة 2 دقيقة. ثم الشروع في إزالة الإبرة بسلاسة وببطء.
26. الصمغ على الجرح الجراحي وإزالة الحيوان من الجهاز المجسم ووضع الحيوانات في قفص قبل تحسنت تحتوي على سرير نظيف للانتعاش التخدير.
27. لتوفير ما بعد الجراحة تلقى تسكين جميع الحيوانات 5 ملغ / كغ تحت الجلد Ketorolac كل ساعة 12 لمدة 24 ساعة.

ممثل النتائج :

عند اتباع هذا البروتوكول ، ويتم الحصول على حقن دقيقة جدا ومسار الإبرة ضيقة جدا تقلل من إصابات الدماغ. نتيجة ممثل هذا الأسلوب ، نحن حقن lysophosphatidyl الكولين (lysolecithin) في الجسم الثفني التي تنتج من إزالة الميالين مساحات المادة البيضاء 1-4. للحد من إصابات الدماغ التي تنتجها الإبرة الزجاج ، وحقن نحن فقط من 20 NL lysolecithin في الجسم الثفني ، ولكن يمكن حقن كميات أكبر إذا كان ذلك مطلوبا بقدر 200 NL مع نفس الأسلوب. تم الكشف عن إزالة الميالين بواسطة الغائب التعبير بروتين النخاعين الأساسي في مساحات المادة البيضاء (الشكل 2).

الشكل 1. إبرة الزجاجية التي يبلغ قطرها 50 ميكرومتر. المسافة قصيرة بين اثنين من القرادفي جدول يمثل طول 50 ميكرومتر.

حقن Lysolecithin الرقم 2. في الجسم الثفني. ويرد إزالة الميالين كتعبير المايلين لا البروتين الأساسي (منطقة منقط). لاحظ صغر حجم الجهاز إبرة الزجاج (الأسهم). بار = 100 ميكرومتر

Discussion

وأظهرت الأسلوب في هذا الفيديو هو مفيد جدا لتقديم معظم العقاقير أو ناقلات فيروسية في أماكن دقيقة جدا في الدماغ. بعض المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي موثوقية نقطة الاستهداف ، ودقة من الحقن وصغر حجم المخ ، والضرر الآفة المسالك ^{1 ، 2 ، 5 ، 6.} يجب مرة واحدة موحدة هي تقني...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary glass tube	Wiretrol I	5-000-1001
Micropipette puller	Kopf Instruments	Model 730
Microforge	World Precision Instruments, Inc.	Model 48000
Mineral oil	MSDS	M7700
High-vacuum grease	Dow Corning	05054-AB
Anesthesia: 2.5% Avertin			2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v
Heater pad	Mastex	Model 900
Stereotactic device	Kopf Instruments	Model Kopf-900
Surgical scalpel blade # 15	Medi-Cut
Micro driller	Ideal Micro Drill	67-1000
Fine forceps	Fine Science Tools
1-μL Micropipette	Rainin
Parafilm M.
Surgical microscope	Carl Zeiss, Inc.	Vasiorkop with Contraves system
Microinjector	Narishige International	Model MO-10