마약, 바이러스성 벡터, 또는 세포 이식 전달 Microinjections 깊은 뇌 구조의 타겟팅

요약

이 문서에서는, 우리는 50 μm의 루멘과 유리 모세관 바늘을하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 크게, 뇌 손상을 감소 약물의 수동적 확산을 최소화하고 쥐 두뇌에 정확한 타겟팅을 수 있습니다.

초록

뇌 실질에 Microinjections 마약, 바이러스성 벡터 또는 세포 이식을 전달하는 것이 중요 절차입니다. 주사 바늘는 궤도 도중에 생성되는 뇌 병변뿐만 아니라 두뇌가 작은뿐만 아니라 때로는 여러 개의 주사가 필요합니다 특히 마우스 두뇌의 주요 관심사입니다. 우리는 여기서 크게 뇌 손상을 감소하고 쥐 두뇌에 정확한 타겟팅을 수있는 50 μm의 루멘과 유리 모세관 바늘을 생산하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 작은 볼륨의 전달 (20-100 NL에서)는, 출혈 위험을 줄일 수 있도록하고, 뇌 실질 조직에 약물의 수동적 확산을 최소화합니다. 모세관 유리 튜브의 다른 크기를 사용하거나 바늘 루멘을 변경하여, 물질과 세포의 여러 종류의 주입 수 있습니다. 유리 모세관과 Microinjections는 분사 기술과 소형 설치류에 최소한의 피해 타겟팅 깊은 두뇌에 상당한 개선을 나타냅니다.

프로토콜

1. 마우스 수술 전에 유리 바늘 만들기 :
   1. micropipette의 풀러의 모세관 유리 튜브를 넣어.
   2. 지역화된 영역의 유리 튜브를 부드럽게하는 유리 튜브의 가운데를 열.
   3. 지역화된 영역의 유리 튜브의 직경의 감소를 일으킬 수있는 충분한 초기 거리하여 세로 축을 따라 유리관을 스트레치.
   4. 그것이 휴식 때까지 유리 튜브를 스트레칭 유지. 이런 방식으로 두 개의 동일한 하나의 배럴의 바늘은 얻을 수 있습니다.
2. microforge에 유리 바늘을 넣어. 30 ° 각도만큼 베벨 팁을하는 것입니다.
3. 각각의 바늘이 정확한 내경을 가지고있는 현미경으로 확인합니다. 친수성 약물의 대부분 30-50 μm의 내경은 (그림 1) 이상적인 제품입니다.
4. 유리 바늘의 넓은 끝에서 광유로 바늘을 입력합니다. 그걸로 모세관 튜브의 길이의 ~ 50 %에 도달할 때까지 미네랄 오일 (MSDS, 고양이. M7700) 모세관 현상에 의해 입력하자. 입어 높은 진공 바늘의 넓은 끝을 밀봉하는 플런저 주변 그리스 (다우 코닝, 고양이. 05054 - AB).
5. 바늘의 넓은 말까지 플런저를 넣고 기름의 작은 방울이 유리 바늘 끝을 들락날락 때까지 부드럽게 미네랄 오일을 밀어.
6. microinjector의 소유자에 유리 바늘을 고정합니다.
7. 2.5 % Avertin (2,2,2 - tribromoethanol + tert - 아밀 알코올, 1시 1분 W / V)와 마우스를 마취. Dosis g intraperitoneal 당 25 30μL.
8. 37 동물의 체온을 유지하는 stereotactic 장치 ° C.에 히터 패드를 넣어
9. 장소 및 귀 바, 치아 홀더를 사용하여 stereotactic 장치에서 마우스 머리를 확보.
10. 두 번째 시간을 70 % 에탄올과 0.1 % Chlorhexidine 글루 콘 산 다음에 0.1 % Chlorhexidine 글루 콘 산 솔루션으로 마우스 머리를 청소하십시오.
11. Lamba 스컬 라인에 마우스 귀를에서 수술 블레이드 # 15 피부를 절개.
12. 그것을 건조하고 수술 현장에서 피부를 잡아 면봉 스왑으로 두개골을 폴란드어.
13. Bregma의 봉합의 정점에서 시점에 유리 바늘의 팁을 사용하십시오. 여기 주입기 (좌표 "제로")의 초기 위치를 설정해야합니다.
14. "X"와 두개골을 통해 stereotactic 장치의 "Y"축을 이동하여 몰락하는 지점을 설정합니다.
15. 선택한 좌표에 매우 조심스럽게 구멍을 드릴. Microdrills 및 기타 금속 도구는 이전에 다음 ID 250에 소독을했다 ° 마른 유리 구슬 살균기와 함께 60 초 동안 C (콜 팔머, 고양이. 번호 EW - 10779-00).
16. 좋은 포셉 조심스럽게 뼈의 가장 깊은 층을 제거하고 duramatter 막을 (당신이 밖으로 누출 일부 대뇌 척수를 볼 수 있습니다) 휴식과 함께.
17. 그 바늘이 뚫고 구멍 갈 수 확인합니다.
18. 당신은 parafilm의 작은 조각에 주사하고 데려가고 싶다는 약물의 피펫 1 μl.
19. 두개골에 parafilm 놔.
20. 당신은 액체가 유리 바늘로 올라간다는 것을 현미경으로 확인하면서, microinjector 휠을 회전하여 약물을 빨아.
21. parafilm를 제거하고 제로 좌표를 다시 설정합니다.
22. 유리 바늘 끝이 부드럽게 뇌의 표면을 만지 제로에서 "Z"좌표를 설정할 때까지 홀더 아래, 선택한 좌표에 바늘을 이동합니다.
23. 선택 깊이에서 뇌 실질에 유리 바늘을 소개합니다.
24. 천천히 ~ 1 NL / 초의 속도로 약물을 주사.
25. 원하는 볼륨이 분사되면, 2 분 실질에 마약 확산하자. 그런 다음 부드럽게 천천히 바늘을 제거하는 진행합니다.
26. 접착제는 수술 상처와 stereotactic 장치에서 동물을 제거하고 마취 복구를 위해 깨끗한 침대를 포함하는 미리 예열 케이지에 동물을 넣어.
27. 이후 수술 진통제를 제공하기 위해 모든 동물은 24 H. 5 MG / kg 피하 Ketorolac 매 12 시간을 받았습니다

대표 결과 :

이 프로토콜을 따라하면, 매우 정확하게 주사는 취득과 매우 좁은 바늘 트랙 뇌 손상을 최소화합니다. 이 방법의 대표적인 결과로, 우리는 흰 물질의 책자 1-4 demyelination를 생산 코퍼스의 callosum에 lysophosphatidyl 콜린 (lysolecithin)을 주입했다. 유리 바늘에 의해 생산되는 뇌 손상을 최소화하기 위해, 우리는 코퍼스의 callosum에 lysolecithin의 20 NL을 주입, 200 NL만큼 필요한 경우에는 높은 볼륨이 동일한 방법으로 주입 수 있습니다. Demyelination은 흰색 물질 책자 (그림 2)에서 myelin 기본 단백질 표현의 부재에 의해 감지됩니다.

그림 1. 50 μm의 직경 유리 바늘. 이 짧은 거려 사이의 거리규모에 50 μm의 길이를 나타냅니다.

코퍼스의 callosum 그림 2. Lysolecithin 분사. Demyelination은 myelin 기본 단백질 표현 (점선 영역) 없음으로 표시됩니다. 유리 바늘 트랙트 (화살표)의 작은 크기를합니다. 바 = 100 μm의

토론

방법은 두뇌에 매우 정확한 장소에 약물이나 바이러스 벡터의 대부분을 제공하는 매우 유용합니다이 비디오에서 보여주었다. 이 기술의 주요 장점 중 일부는 표적 지점, 주사의 정확성 및 뇌 병변 및 요로 손상 ^{1, 2, 5, 6의} 작은 크기의 신뢰성입니다. 일단 기술이 mistargeting의 범위 표준화되어 있어야 50 μm의 또는 ^{2, 1} 이하. 세포 이식은 또한 더 넓은, 100-150 μm의 ^7-9, 바늘을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary glass tube	Wiretrol I	5-000-1001
Micropipette puller	Kopf Instruments	Model 730
Microforge	World Precision Instruments, Inc.	Model 48000
Mineral oil	MSDS	M7700
High-vacuum grease	Dow Corning	05054-AB
Anesthesia: 2.5% Avertin			2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v
Heater pad	Mastex	Model 900
Stereotactic device	Kopf Instruments	Model Kopf-900
Surgical scalpel blade # 15	Medi-Cut
Micro driller	Ideal Micro Drill	67-1000
Fine forceps	Fine Science Tools
1-μL Micropipette	Rainin
Parafilm M.
Surgical microscope	Carl Zeiss, Inc.	Vasiorkop with Contraves system
Microinjector	Narishige International	Model MO-10