İlaçlar, Viral Vektörler, veya Hücre Transplantasyon teslimi için Microinjections Derin Beyin Yapıları Hedefleme

Özet

Bu makalede, 50 mikron lümen cam kılcal iğneler yapmak için bir yöntem gösteriyor. Bu teknik, beyin hasarı önemli ölçüde azaltır, ilaç pasif difüzyon en aza indirir ve kemirgen beyin içine hassas bir hedefleme sağlar.

Özet

Beyin parankimi içine Microinjections ilaçlar, viral vektörlerin veya hücre nakli sunmak için önemli prosedürler vardır. Bir enjeksiyon iğnesi, yörünge sırasında ürettiği beyin lezyonu sadece beyin küçük ama aynı zamanda bazen çoklu enjeksiyon ihtiyaç vardır özellikle fare beyinde önemli bir husustur. Biz burada cam kılcal iğneler beyin hasarı önemli ölçüde azaltır ve kemirgen beyin içine hassas bir hedefleme sağlar 50 mikron lümen üretmek için bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem, küçük hacimli bir teslimat (20 100 nl), kanama riskini azaltır sağlar ve beyin parankimi içine ilaç pasif difüzyon en aza indirir. Farklı boyutta kılcal cam tüpler kullanarak veya iğne lümen değişen, çeşitli madde ve hücreler enjekte edilebilir. Cam kapiller tüp ile Microinjections enjeksiyon teknikleri ve küçük kemirgenler minimum teminat hasar hedefleyen derin beyin önemli bir iyileşme temsil eder.

Protokol

1. Fare ameliyat öncesi cam iğneler olun:
   1. Mikropipet çektirmenin kapiller cam tüp koyun.
   2. Yerelleştirilmiş alan cam tüp yumuşatmak için cam tüp ortasında ısıtın.
   3. Uzunlamasına eksen boyunca cam tüp, yerelleştirilmiş alan cam tüp çapı bir azalma neden olmak için yeterli bir başlangıç ​​mesafe gerin.
   4. Cam tüp kalıncaya kadar uzanan tutun. Bu şekilde, iki özdeş tek varil iğneler elde edilir.
2. Bir microforge cam iğne koyun. A 30 ° açı yeterli konik ucu.
3. Her iğne doğru iç çapı olduğu mikroskop altında kontrol edin. Hidrofilik ilaçların çoğu için bir iç çapı 30-50 mikron idealdir (Şekil 1).
4. Mineral yağ ile en geniş cam iğne ucundan iğne doldurun. ~ 50% kılcal tüpün uzunluğu ulaşıncaya kadar mineral yağ (MSDS, Cat M7700) kapilarite girer edelim. Koyun yüksek vakum iğne geniş sonlandırma piston etrafında yağ (Dow Corning, Kedi 05.054-AB).
5. Piston iğne geniş sonuna kadar yerleştirin ve hafifçe mineral yağ küçük bir damla yağ cam iğne ucu çıkıyor görüldüğü kadar itin.
6. Mikroenjektör sahibi cam iğne sabitleyin.
7. % 2.5 Avertin (2,2,2-tribromoethanol + tert-amil alkol, 1:1 w / v) ile fare anestezisi. Dosis gram intraperitoneal başına 25-30μL.
8. 37 hayvanın vücut sıcaklığı tutmak için stereotaktik cihaz ° C üzerinde bir ısıtıcı yastık koyun
9. Stereotaktik cihaz, kulak çubukları ve dişlerin tutucu kullanarak fare baş koyun ve güvenli.
10. Ikinci kez% 70 Etanol ve% 0.1 Klorheksidin glukonat% 0.1 Klorheksidin glukonat çözüm, fare kafasını temizleyin.
11. Lamba kafatası hattı fare kulakları bir cerrahi bıçak # 15 cilt İnsizyon.
12. Kurumasına ve cerrahi alanında cilt çekin bir pamuk takas kafatası Lehçe.
13. Bregma dikiş tepe noktasında cam iğne ucu kullanın. Enjektör ("sıfır" koordinat) başlangıç ​​konumunu ayarlamak zorunda.
14. "X" ve "Y" kafatası üzerinde stereotaktik cihazın eksen hareket ettirerek delinmiş noktayı ayarlayın.
15. Seçilen koordinat çok dikkatli bir delik delin. Microdrills ve diğer metal aletler daha önce 250 sterilize ° C kuru bir cam boncuk sterilizatör ile 60 saniye (Cole Palmer, Kedi No EH-10.779-00).
16. Ince forseps kemik derin tabaka dikkatlice çıkarın ve duramatter membran (bazı beyin omurilik sıvısı dışarı sızdıran göreceksiniz) break ile.
17. Iğne delikli gidebilirsiniz onaylayın.
18. Pipet 1 parafilm küçük bir parça enjekte koymak istediğiniz ilaç ul.
19. Parafilm kafatası üzerine koyun.
20. Sıvı cam iğne içine kadar gidiyor mikroskop altında kontrol ederken, mikroenjektör Çarkın dönmesi ilaç emer.
21. Parafilm çıkarın ve sıfır koordinat yeniden ayarlanmalıdır.
22. Cam iğne ucu beyin yüzeyini hafifçe dokunun ve sıfırdan "Z" koordine kadar tutucu aşağı, seçilen koordinatlarına iğne taşıyın.
23. Seçilen derinlikte beyin parankimi içine cam iğne tanıtmak.
24. ~ 1 nl / sn hızında yavaş yavaş ilaç enjekte edilir.
25. Arzu hacim enjekte edildiğinde, 2 dakika süreyle parankimi içine ilaç diffüz sağlar. Sonra yumuşak ve yavaş yavaş iğne kaldırmak için devam edin.
26. Tutkal cerrahi yara ve hayvan stereotaktik cihazdan çıkarmak ve hayvan anestezi kurtarma için temiz bir yatak içeren önceden ısıtılmış bir kafese koymak.
27. Post-operatif analjezi sağlamak için tüm hayvanların 24 saat için 5 mg / kg subkutan Ketorolak alınan her 12 saat

Temsilcisi Sonuçlar:

Bu protokol, bir çok hassas enjeksiyon elde edilen ve çok dar bir iğne parça beyin hasarı en aza indirir. Bu yöntem bir temsilcisi Sonuç olarak, beyaz cevher yolları 1-4 demiyelinizasyon üreten korpus kallosum içine enjekte lysophosphatidyl kolin (lysolecithin). Cam iğne ile üretilen beyin hasarı en aza indirmek için, biz sadece lysolecithin, 20 nl korpus kallosum içine enjekte edilen, ancak 200 nl kadar kadar eğer gerekli yüksek hacimli aynı yöntemi ile enjekte edilebilir. Demiyelinizasyon beyaz cevher yolları (Şekil 2) miyelin temel protein ifade yok tarafından algılanır.

Şekil 1. 50 mikron çaplı cam iğne. İki kısa keneler arasındaki mesafe50-mikron ölçeğinde bir uzunluğu temsil eder.

Şekil 2 korpus kallosum Lysolecithin enjeksiyon. Demiyelinizasyon miyelin temel protein ifade (noktalı alan) olarak gösterilmiştir. Küçük boyutlu cam iğne yolu (oklar) dikkat edin. Bar = 100 mikron

Tartışmalar

Bu yöntem beynin içine çok hassas yerlere ilaçlar veya viral vektörlerin en sunmak için çok yararlı olan bu video gösterdi. Bu tekniğin başlıca avantajlarından bazıları hedefleme nokta enjeksiyonları doğruluğu ve beyin lezyon ve sistem zarar ^{1, 2, 5, 6} küçük boyutlu güvenilirliğini. Sonra teknik mistargeting aralığında standardize 50 mm veya ^{1, 2} daha az. Hücre nakli aynı zamanda daha geniş, 100-150 mikron ^7-9, iğneler kullanılarak yapılabilir. Bu nedenle ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary glass tube	Wiretrol I	5-000-1001
Micropipette puller	Kopf Instruments	Model 730
Microforge	World Precision Instruments, Inc.	Model 48000
Mineral oil	MSDS	M7700
High-vacuum grease	Dow Corning	05054-AB
Anesthesia: 2.5% Avertin			2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v
Heater pad	Mastex	Model 900
Stereotactic device	Kopf Instruments	Model Kopf-900
Surgical scalpel blade # 15	Medi-Cut
Micro driller	Ideal Micro Drill	67-1000
Fine forceps	Fine Science Tools
1-μL Micropipette	Rainin
Parafilm M.
Surgical microscope	Carl Zeiss, Inc.	Vasiorkop with Contraves system
Microinjector	Narishige International	Model MO-10