Segmentação de estruturas cerebrais profundas com Microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou Transplantes de Células

Resumo

Neste artigo, vamos mostrar um método para fazer agulhas capilar de vidro com um lúmen 50 mícrons. Esta técnica reduz significativamente os danos cerebrais, minimiza difusão passiva de drogas e permite uma segmentação precisa no cérebro de roedores.

Resumo

Microinjeções no parênquima cerebral são procedimentos importantes para entregar drogas, vetores virais ou transplantes de células. A lesão cerebral que uma agulha de injeção produz durante sua trajetória é uma grande preocupação, especialmente no cérebro do rato, não só para o cérebro é pequeno, mas às vezes também de múltiplas injeções são necessárias. Mostramos aqui um método para produzir agulhas capilar de vidro com um lúmen 50 mícrons, que reduz significativamente os danos cerebrais e permite uma segmentação precisa no cérebro de roedores. Este método permite uma entrega de pequenos volumes (20-100 nl), reduz os riscos de sangramento, e minimiza a difusão passiva de drogas dentro do parênquima cerebral. Usando diferentes tamanhos de tubos capilares de vidro, ou mudando o lúmen da agulha, vários tipos de substâncias e células pode ser injetado. Microinjeções com um tubo de vidro capilar representam uma melhoria significativa nas técnicas de injeção e cerebral profunda segmentação com danos colaterais mínimos em pequenos roedores.

Protocolo

1. Fazer agulhas de vidro antes da cirurgia mouse:
   1. Coloque o tubo de vidro capilar em um extrator de micropipeta.
   2. O calor do meio do tubo de vidro para suavizar o tubo de vidro na área localizada.
   3. Estique o tubo de vidro ao longo de seu eixo longitudinal por uma distância inicial suficiente para causar uma redução no diâmetro do tubo de vidro na área localizada.
   4. Mantenha o tubo de vidro que se estende até que quebre. Desta forma, dois idênticos agulhas único barril são obtidos.
2. Coloque a agulha de vidro em uma microforge. Um ângulo de 30 ° é suficiente para chanfrar a ponta.
3. Verifique sob o microscópio que cada agulha tem o diâmetro correto interior. Para a maioria das drogas hidrofílicas um diâmetro 30-50 mM interior é ideal (figura 1).
4. Encha-se a agulha com óleo mineral a partir da maior final de agulha de vidro. Deixe que o óleo mineral (MSDS, Cat. M7700) entra por capilaridade, até atingir ~ 50% do comprimento do tubo capilar. Coloque a vácuo de alta gordura (Dow Corning, Cat. 05054-AB) em todo o êmbolo para selar o maior ponta da agulha.
5. Insira o êmbolo pelo maior ponta da agulha e empurre delicadamente o óleo mineral até que uma pequena gota de óleo é visto saindo da ponta da agulha de vidro.
6. Segura a agulha de vidro no suporte do microinjetor.
7. Anestesiar o rato com Avertin 2,5% (2,2,2-tribromoetanol + terc-amil álcool, 01:01 w / v). Dose de 25 30μL por grama intraperitoneal.
8. Coloque uma almofada de aquecimento no aparelho estereotáxico para manter a temperatura corporal do animal a 37 ° C.
9. Lugar e segura a cabeça do rato no dispositivo estereotáxico usando barras de ouvido e um suporte de dentes.
10. Limpe a cabeça do rato com a solução de gluconato de clorexidina 0,1%, seguido por etanol 70% e gluconato de clorexidina 0,1% pela segunda vez.
11. Inciso a pele com uma lâmina cirúrgica # 15 de orelhas de rato para a linha do crânio Lamba.
12. Polonês do crânio com um cotonete para secar o produto e puxar a pele para fora do campo cirúrgico.
13. Use a ponta da agulha de vidro para apontar para o vértice da sutura bregma. Lá você tem que definir a posição inicial do injetor (a coordenada "zero").
14. Definir o ponto a ser perfurado, movendo o "X" e "Y" eixo do dispositivo estereotáxico sobre o crânio.
15. Broca com muito cuidado buracos na coordenada selecionada. Microdrills e ferramentas de outros metais foram previamente esterilizado a 250 ° C por 60 segundos com um pano seco de contas de vidro esterilizador (Cole Palmer, Cat. No. EW-10779-00).
16. Com uma pinça fina remover com cuidado a camada mais profunda do osso e romper a membrana duramatter (você vai ver algum fluido cérebro-espinhal vazando).
17. Confirmar que a agulha pode passar por buracos perfurados.
18. Pipetar 1 mL da droga você quer injetar e colocá-lo em um pequeno pedaço de parafilme.
19. Coloque o parafilme sobre o crânio.
20. Sugam a droga girando a roda microinjetor, enquanto verifica sob o microscópio que o fluido está subindo para dentro da agulha de vidro.
21. Remover o parafilme e re-definir a coordenar zero.
22. Mover a agulha para as coordenadas selecionado, o porta até que a ponta da agulha de vidro tocar suavemente na superfície do cérebro e definir a "Z" coordenar a zero.
23. Introduzir a agulha de vidro para o parênquima cerebral em profundidade selecionada.
24. Injetar a droga lentamente a uma taxa de ~ 1 nl / sec.
25. Quando o volume desejo é injetado, deixe o difuso de drogas dentro do parênquima por 2 min. Em seguida, avance para remover a agulha suavemente e lentamente.
26. Cola a ferida cirúrgica e remover o animal a partir do dispositivo estereotáxico e colocar o animal em uma gaiola pré-aquecido contendo uma cama limpa para a recuperação da anestesia.
27. Para fornecer analgesia pós-operatória todos os animais receberam 5 mg / kg subcutânea Ketorolac cada hora de 12 para 24 h.

Resultados representativos:

Ao seguir este protocolo, uma injeção muito precisa é obtida e uma faixa muito estreita agulha minimiza lesão cerebral. Como resultado representante deste método, injetamos lysophosphatidyl colina (lysolecithin) no corpo caloso, que produz desmielinização de tratos de substância branca 1-4. Para minimizar a lesão cerebral produzido pela agulha de vidro, injetou apenas 20 nl de lysolecithin no corpo caloso, mas se necessário maior volume de até 200 nl pode ser injetado com o mesmo método. Desmielinização é detectada pela ausência de mielina expressão da proteína básica na tratos de substância branca (Figura 2).

Figura 1. Uma agulha de vidro com um diâmetro de 50 mícrons. Distância entre dois ticks curtana escala representa um comprimento de 50 mícrons.

Figura injeção Lysolecithin 2. No corpo caloso. Desmielinização é mostrado como um não a expressão da proteína básica de mielina (área pontilhada). Observe o pequeno tamanho do vidro do trato agulha (setas). Bar = 100 mm

Discussão

O método mostrou neste vídeo é muito útil para entregar a maioria das drogas ou vetores virais em lugares muito precisos para o cérebro. Algumas das principais vantagens desta técnica são a confiabilidade do ponto de focalização, a precisão das injeções eo pequeno tamanho da lesão cerebral e danos trato ^{1, 2, 5, 6.} Uma vez que a técnica é padronizada a faixa de 50 mm deve mistargeting ou menos ^{1, 2.} Transplantes de células também pode ser feito usando mais amplo, 100-150 mM ^7-...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary glass tube	Wiretrol I	5-000-1001
Micropipette puller	Kopf Instruments	Model 730
Microforge	World Precision Instruments, Inc.	Model 48000
Mineral oil	MSDS	M7700
High-vacuum grease	Dow Corning	05054-AB
Anesthesia: 2.5% Avertin			2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v
Heater pad	Mastex	Model 900
Stereotactic device	Kopf Instruments	Model Kopf-900
Surgical scalpel blade # 15	Medi-Cut
Micro driller	Ideal Micro Drill	67-1000
Fine forceps	Fine Science Tools
1-μL Micropipette	Rainin
Parafilm M.
Surgical microscope	Carl Zeiss, Inc.	Vasiorkop with Contraves system
Microinjector	Narishige International	Model MO-10