Ориентация глубинных структур мозга с Микроинъекции для доставки лекарственных средств, вирусные векторы, или клеточных трансплантатов

Резюме

В этой статье мы покажем способ сделать стеклянный капилляр иглы с 50-мкм просвет. Этот метод значительно сокращает повреждение головного мозга, снижает пассивной диффузии лекарственных препаратов и позволяет точного прицеливания в грызун мозга.

Аннотация

Микроинъекции в паренхимы мозга важны процедуры доставки лекарств, вирусных векторов или клеточных трансплантатов. Поражение головного мозга, что инъекционные иглы производит во время его траектория представляет собой серьезную проблему, особенно в мозге мыши не только мозг маленький, но также иногда многократные инъекции необходимы. Мы покажем здесь метод получения стеклянных капиллярных игл с 50-мкм просвета что значительно сокращает повреждение головного мозга и позволяет точного прицеливания в грызун мозга. Этот метод позволяет доставка небольших объемах (от 20 до 100 п), уменьшает кровотечение риски и свести к минимуму пассивной диффузии препаратов в мозг паренхимы. При использовании различных размеров капилляров стекло, или изменения просвета иглы, несколько типов веществ и клеток может быть введен. Микроинъекции со стеклянной капиллярной трубке представляют собой значительное улучшение инъекционным методикам и глубокие мозга ориентации с минимальным сопутствующим ущербом в мелких грызунов.

протокол

1. Сделайте стекло иглы перед мыши хирургии:
   1. Положите капиллярной стеклянной трубки в съемник микропипетки.
   2. Тепло середине стеклянной трубки, чтобы смягчить стеклянной трубки в локализованной области.
   3. Стретч стеклянную трубку вдоль его продольной оси на начальное расстояние достаточно, чтобы вызвать сокращение диаметр стеклянной трубки в локализованной области.
   4. Держите растяжку стеклянную трубку, пока его разрыва. Таким образом, два одинаковых одной иглы баррель получаются.
2. Положите стекло иголку в microforge. Углом 30 ° достаточно конических наконечника.
3. Проверьте под микроскопом, что каждая игла имеет правильный внутреннего диаметра. Для большинства из гидрофильных препаратов 30-50 мкм, внутренний диаметр идеально (рис. 1).
4. Заполнение иглы с минеральным маслом из самого широкого конца стеклянной иглы. Пусть это минеральное масло (MSDS, кат. M7700) входит по капиллярности, пока не достигнет ~ 50% от длины капилляра. Положите высоковакуумной смазкой (Dow Corning, Кат. 05054-AB) вокруг плунжера для герметизации широкого конце иглы.
5. Вставьте поршень на широкий конец иглы и нажмите мягко минеральное масло, пока маленькая капля масла видел выход из кончик стеклянной иглы.
6. Безопасные стеклянные иглу в держатель microinjector.
7. Обезболить мышь с 2,5% Avertin (2,2,2-tribromoethanol + трет-амиловый спирт, 1:1 в / о). DOSIS 25-30μL на грамм внутрибрюшинно.
8. Положите нагреватель накладка на стереотаксической устройство держать температуру тела животного при температуре 37 ° C.
9. Место и безопасный мыши головой в стереотаксической устройства с помощью уха баров и зубы держателя.
10. Чистая мыши головой с 0,1% раствором хлоргексидина глюконата, а затем на 70% этанола и 0,1% хлоргексидина глюконата для второй раз.
11. Надрезать кожу хирургические лезвия № 15 от мыши уши, чтобы линия черепа Ламба.
12. Польские черепа с хлопком своп для сухой его и вытащить из кожи операционного поля.
13. Используйте кончик стеклянной иглы в точку в вершине шва брегмы. Там вы должны установить начальное положение инжектора (координата "ноль").
14. Выберите точку для бурения путем перемещения "X" и "Y" оси стереотаксической устройства через череп.
15. Дрель очень тщательно отверстия в выбранных координат. Microdrills и другим металлическим инструментом, ранее стерилизуют при 250 ° С в течение 60 секунд и сухих стеклянных бус стерилизатор (Cole Palmer, Кат. EW-10779-00).
16. С тонкой пинцетом осторожно удалить глубокий слой кости и разрыв duramatter мембраны (вы увидите некоторые спинномозговую жидкость утечки).
17. Убедитесь, что игла может пройти через просверленные отверстия.
18. Внесите 1 мкл препарат нужно вводить и положил его на маленький кусочек парафильмом.
19. Положите парафильмом на черепе.
20. Соси в состав препарата, крутя колесо microinjector, в то время как вы проверяете под микроскопом, что жидкость идет вверх в стеклянную иглу.
21. Удалить парафильмом и повторно установить нулевую координату.
22. Перемещение иглы выбраны координаты, вплоть до держателя кончик стеклянной иглы осторожно прикасаться к поверхности мозга и установить "Z" координат в нуле.
23. Ввести иглу в стекло паренхимы мозга на выбранной глубине.
24. Вводите препарат медленно со скоростью ~ 1 п / с.
25. При желании объем вводят, не говоря наркотиков диффундировать в паренхиму в течение 2 мин. Затем переходите к удалить иглу плавно и медленно.
26. Клей хирургических ран и снять животное от стереотаксической устройства и положил животное в подогретого клетку содержащую чистую постель для наркоза.
27. Для обеспечения послеоперационного обезболивания все животные получали 5 мг / кг подкожного Кеторолак каждые 12 часа в течение 24 ч.

Представитель Результаты:

Когда после этого протокола, очень точный впрыск получается и очень узкие иглы трек сводит к минимуму повреждения мозга. Как представитель результате этого метода, мы вводили lysophosphatidyl холин (лизолецитин) в мозолистое тело, которое производит демиелинизации белого путей дело 1-4. Чтобы свести к минимуму травмы головного мозга производства стеклянной иглы, мы вводили только 20 п о лизолецитина в мозолистого тела, а при необходимости увеличения объемов до 200 п может быть введен с тем же методом. Демиелинизации обнаруживается отсутствие миелина основных экспрессии белка в белом участки материи (рис. 2).

Рисунок 1. Стеклянной иглы с 50-мкм в диаметре. Расстояние между двумя короткими клещейв масштабе представляет собой 50-мкм длиной.

Рисунок 2. Лизолецитина инъекций в мозолистое тело. Демиелинизации показан как не миелина основных экспрессии белка (пунктирная область). Обратите внимание на небольшие размеры стеклянных иглу-кишечного тракта (стрелки). Бар = 100 мкм

Обсуждение

Метод показал в этом видео очень полезно для доставки большинства лекарств или вирусных векторов в очень точные места в мозгу. Некоторые из основных преимуществ этого метода являются надежность ориентации точки, точность инъекций и небольшие размеры поражения мозга и повреждение пут...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary glass tube	Wiretrol I	5-000-1001
Micropipette puller	Kopf Instruments	Model 730
Microforge	World Precision Instruments, Inc.	Model 48000
Mineral oil	MSDS	M7700
High-vacuum grease	Dow Corning	05054-AB
Anesthesia: 2.5% Avertin			2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v
Heater pad	Mastex	Model 900
Stereotactic device	Kopf Instruments	Model Kopf-900
Surgical scalpel blade # 15	Medi-Cut
Micro driller	Ideal Micro Drill	67-1000
Fine forceps	Fine Science Tools
1-μL Micropipette	Rainin
Parafilm M.
Surgical microscope	Carl Zeiss, Inc.	Vasiorkop with Contraves system
Microinjector	Narishige International	Model MO-10