Method Article
يصف هذا البروتوكول مقايسة على أساس النشاط لاكتشاف metalloproteinases مصفوفة في supernatants الثقافة أو سوائل الجسم.
metalloproteinases المصفوفة (MMPs) هي التي تحتوي على الزنك endopeptidases. انها تتحلل البروتينات التي تشطر سندات ببتيد. وقد تم تحديد أكثر من عشرين MMPs ويتم فصل إلى ست مجموعات على أساس بنيتها التحتية ونوعية (collagenases ، gelatinases ، نوع الغشاء [MT - MMP] ، stromelysins ، matrilysins ، وغيرها). MMPs تلعب دورا حاسما في غزو الخلية ، وتدهور الغضاريف ، إعادة تشكيل الأنسجة والتئام الجروح ، والتخلق. ولذلك كانت تشارك في كل العمليات الطبيعية والمرضية في كثير من الأمراض ، مثل التهاب المفاصل الروماتيزمي ، والسرطان ، أو مرض الانسداد الرئوي المزمن 1-6. هنا ، سوف نركز على MMP - 2 (جيلاتيناز A ، النوع الرابع كولاجيناز) ، وأعرب عن MMP على نطاق واسع. سوف نقوم شرح كيفية الكشف عن MMP - 2 في خلية ثقافة supernatants zymography ، وهي شائعة الاستخدام ، وتقنية بسيطة ، وحتى الآن حساسة للغاية لأول مرة في عام 1980 من قبل المجلس التنفيذي وHeussen جيم Dowdle 70-10. هذا الأسلوب هو نصف الكمية ، ويمكن بالتالي استخدامها لتحديد مستويات MMP في عينات الاختبار عندما يتم تحميل تركيزات المعروفة MMP المؤتلف على نفسه جل 11.
يتم تحميل محاليل تحتوي على MMPs (مثل supernatants خلية ثقافة والبول ، أو مصل) إلى مادة هلامية تحتوي على كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد دوديسيل (SDS ؛ ليصبح خطي البروتينات) ، والجيلاتين (الركيزة لMMP - 2). تم تصميم العينة عازلة لزيادة اللزوجة عينة (لتسهيل التحميل هلام) ، وتوفير صبغة التتبع (أزرق bromophenol ؛ لمراقبة الهجرة العينة) ، وتقديم الجزيئات تغيير طبيعة (ليصبح خطي البروتينات) ، والتحكم في درجة الحموضة في العينة. ويسمح للبروتينات ثم إلى الهجرة تحت تيار كهربائي في منطقة عازلة مصممة لتوفير تشغيل معدل الهجرة المستمرة. يرتبط ارتباطا عكسيا المسافة للهجرة مع الوزن الجزيئي للبروتين (بروتينات صغيرة تتحرك بشكل أسرع من خلال هلام من البروتينات ، وبالتالي لا كبيرة ترحيل مزيد من أسفل الجل). بعد الهجرة ، ويتم وضع الجل في renaturing عازلة للسماح للبروتينات لاستعادة بنيتها العالي ، واللازمة لنشاط الأنزيمي. ثم يتم وضع الجل في منطقة عازلة مصممة النامية للسماح للبروتياز لهضم ركيزة لها. المخزن يحتوي أيضا على تطوير ف aminophenylmercuric خلات (APMA) لتنشيط بروتين غير الموالية للMMPs في MMPs النشطة. الخطوة التالية يتكون من تلطيخ الركيزة (الجيلاتين في مثالنا). بعد غسل الصبغة قبالة هلام ، ومجالات الهضم البروتيني تظهر الفرق واضح. وأوضح الفرقة ، وأكثر تركيزا على البروتياز التي يحتوي عليها. ويمكن بعد ذلك الفرقة كثافة تلوين تحددها كثافة ، وذلك باستخدام برامج مثل ImageJ ، مما يسمح للمقارنة العينة.
1. تحميل وتشغيل جل
2. Renaturing وتطوير جل
3. تحليل البيانات
4. ممثل النتائج
نظهر هلام مع 11 بئرا محملة supernatants ثقافة مختلفة الخلية التي تحتوي على كميات مختلفة من MMP - 2 (الشكل 1A). الملاحظة المباشرة لهذا الهلام يظهر اختلافات واضحة في MMP - 2 التركيزات بين بعض الآبار. على سبيل المثال ، فإنه من الواضح أن آبار # 4 و 5 تحتوي على أكثر بكثير من MMP - 2 جيدا أو جيدا # 11 حتى 10 #. الهدف من القياس الكمي للنطاقات استخدمنا قياس كثافة مع برنامج ImageJ (الشكل 1B - D) ، مؤكدا وجود فرق ما يقرب من 4 أضعاف في MMP - 2 كميات جيدة بين 11 و # # الآبار 4 و 5 و فرق ما يقرب من 2 أضعاف في MMP - 2 كميات جيدة بين # 10 # والآبار 4 و 5.
الشكل 1. الكشف عن MMP - 2 بواسطة zymography الجيلاتين. صورة ، الممسوحة ضوئيا من جل الجيلاتين. وأشارت الأرقام بشكل جيد في الجزء العلوي من هلام. ب ، الجل نفسه كما في هو موضح في بالأبيض والأسود لقياس كثافة. وقد تم اختيار كل الفرقة مع مستطيل في ImageJ. C ، وهناك مثالان لمحات عن كثافة الجل هو مبين في ألف وباء (العصابات # # 4 و 11). وقد رسم خط مستقيم عند قاعدة كل الذروة إلى إنشاء منطقة مغلقة. D قطعة من المناطق الذروة للهلام هو مبين في ألف وباء التطبيع (يمين) قبل (يسار) وبعد أن كثافة الفرقة رقم 1.
الشكل 2 ، وهذا الرقم يوضح كيف يمكن استخدام zymography كأسلوب نصف الكمية. وقد حملت لنا التخفيفات المتسلسلة (الخطوات من التخفيفات 01:01) في 7 آبار على التوالي ، وقياس كثافة الموجات على حد سواء المؤيدة - 2 - MMP و MMP - 2.
وقد أثبتت لنا كيفية تنفيذ تحليل zymographic من MMP - 2 في supernatants ثقافة الخلية.
يجب تحديد كمية العينة ليتم تحميلها اعتمادا على هلام تجريبيا في الأصل وMMP من الفائدة. قد تحميل القليل جدا سوف يمنع الكشف أثناء تحميل الكثير يؤدي إلى تشبع وهناك ركيزة فقط بقدر ما هو البروتيني يمكن هضم في مجال الفرقة. يمكن إذا لزم الأمر ، يمكن أن تضعف العينة في الماء منزوع الأيونات قبل الاختلاط العازلة التحميل أو الوقت النامية من خفض دي بين عشية وضحاها إلى 4 ساعات. ومن الممكن أيضا أن تركز البروتينات في حل باستخدام مركزات (مثل ميليبور التسويقي UFC803024 #). إذا نطق تبقى مرئية بالكاد ، قد يكون من الضروري لتطوير المواد الهلامية لفترة أطول من الزمن ، حتى تصل إلى 48 ساعة. عند إعداد عينات من supernatants زراعة الأنسجة ، ينبغي الإشارة إلى أن مصل بقري جنيني (والأمصال الأخرى) يحتوي على MMPs التي يمكن أن تؤثر على النتائج. لهذا السبب ، نقوم بجمع كافة supernatants لدينا ثقافة في المصل بعد خالية من المتوسط.
ويغسل وصفها في الفقرتين 2.9 و 2.10 للبروتوكول ضرورية لإزالة الخلفية من تلطيخ العصابات هضمها. وسوف يعد مرات غسل إزالة أكثر الخلفية ، ولكن قاتمة أيضا تلون الركيزة في جميع أنحاء هلام. إذا غسل أوقات أطول ضرورية ، نوصي مسح هلام كل بضع ساعات لتحديد تفحص مع أفضل التباين.
ويمكن استخدام هذه التقنية لكشف MMPs الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن الكشف عن MMP - 9 على الجيلاتين الهلام ، وأيضا إلى انخفاض مدى MMP - 1 ، MMP - 8 ، 13 - MMP والجيلاتين وليس الركيزة المفضل لديهم. تم الكشف عن أفضل MMP - 1 و MMP - 13 على zymography الكولاجين بينما الكازين هو الركيزة المفضل لMMP - 11 ويسمح أيضا للكشف عن MMP - 1 ، MMP - 3 ، MMP - 7 ، MMP - 12 ، و 13 - MMP 9. MMP - 7 (matrilysin) وcollagenases (MMP - 1 و MMP - 13) يصعب الكشف عندما تكون موجودة عند مستويات منخفضة في الكازين المواد الهلامية أو الجيلاتين. إضافة إلى نموذج الهيبارين في وقت التحميل جل تحسن كبير في الحد من الكشف عن MMP - 7. لMMP - 1 و 13 - MMP ، والهيبارين يحتاج إلى إضافته إلى هلام بعد تشغيل الكهربي جار بالفعل 12.
منذ zymography تدابير النشاط الأنزيمي بعد تمسخ واستعادة الطبيعة من الإنزيمات ، فإنه سيتم قياس نشاط كل MMPs موجودة في العينة. وتشمل هذه الانزيمات ، والانزيمات المؤيدة ، والانزيمات منضمة إلى مثبطات الذاتية (على سبيل المثال TIMP - 2). ومع ذلك فمن الممكن لتحديد مستوى التنشيط MMP في العينة من خلال مقارنة الكثافة عصابة من الإنزيم النشط وذلك لإنزيم للمحترفين ، والتي سوف يكون لها وزن جزيئي أعلى قليلا.
Zymography غالبا ما تكون غير كافية لتحديد هوية MMP. مقارنة بين مستوى الهجرة من MMP مع معايير معروفة الوزن الجزيئي لا يساعد في تحديد الهوية ولكن تجدر الإشارة إلى أن بعض هذه المعايير تتضمن خفض عامل ، وأنه عندما تستخدم في ظل عدم الحد من الظروف التي قد تشير إلى أوزان جزيئية مختلفة 9. الخيار هو لتحميل MMP المؤتلف للذوبان في هلام نفس عينات الاختبار. ولكن قد تكون مرتبطة MMPs مع بروتينات أخرى ، الأمر الذي أدى إلى تغيير في الوزن الجزيئي واضح. يمكن إضافة مثبطات انتقائية لMMP الجل (أو جزء من قطع هلام في نصف) خلال حضانة في المخزن النامية كأدوات الدوائية للهوية يوصى MMP تقنية interest.A الثاني (الغربية وصمة عار ، كيمياء سيتولوجية مناعية ، أو ELISA) ل المساعدة في تحديد هوية MMP من الفائدة. وتجدر الإشارة إلى أن حدود الكشف عن البقع الغربية غالبا ما تكون أقل بكثير من تلك المواد الهلامية zymographic ، مما قد يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة عند استخدام هذه التقنية.
نود أن نشكر الدكتور س. ريسلر (قسم علم الأحياء الجزيئية والخلوية ، وكلية بايلور للطب) ليشير الى ان استخدام مركزات البروتين لزيادة تركيز MMPs supernatants في ثقافة الخلية.
وقد أيد هذا المشروع من المنح المقدمة من الصندوق المسنين السيدة كليفورد غراهام الابيض بحوث وهبوا NIAMS المعاهد الوطنية للصحة / (AR059838) لبناء القدرات. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر رسمية من المعاهد الوطنية للصحة.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | ||
Power supply (model 302) | VWR | 93000-744 | ||
Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | ||
Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | ||
Gel loading tips | VWR | 53509-015 | ||
Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | ||
Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | ||
Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | ||
Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | ||
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | ||
Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | ||
ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved