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本协议描述了一个用于检测培养上清或体液基质金属蛋白酶的活动为基础的检测。
基质金属蛋白酶(MMPs)是含有锌endopeptidases。他们降解蛋白质肽键的断裂。超过20基质金属蛋白酶已经确定,并分隔成六个小组,根据它们的结构和底物特异性(胶原酶,明胶酶,膜型[MT - MMP,stromelysins,matrilysins,和其他人)。基质金属蛋白酶在细胞的浸润,软骨退化,组织重构,伤口愈合和胚胎发育中发挥关键作用。因此,他们在正常的进程,并在许多疾病,如类风湿关节炎,癌症,慢性阻塞性肺疾病 1-6发病的参与。在这里,我们将重点对MMP - 2(明胶酶A,IV型胶原酶),基质金属蛋白酶广泛表达。我们将演示如何检测细胞培养上清液中MMP - 2的酶谱法,一种常用的,简单,但非常敏感的技术,在1980年首次描述C. Heussen 和 EB Dowdle 7-10。这种技术是半定量的,因此它可以被用于确定测试样品基质金属蛋白酶的重组MMP的已知浓度的水平时,装载在同一凝胶11。
聚丙烯酰胺凝胶含有十二烷基硫酸钠(SDS,线性的蛋白质)和明胶(MMP - 2的基板)装上含有基质金属蛋白酶(如细胞培养上清液,尿液或血清)的解决方案。样本缓冲区的目的是为了增加样品粘度(以方便装载凝胶),提供追踪染料(溴酚蓝;监测样本迁移),提供变性分子(线性蛋白质),并控制样品的pH值。蛋白质,然后允许电流下的迁移,在设计,以提供一个恒定的迁移率一个运行缓冲。迁移距离呈负相关的蛋白质的分子量(小分子蛋白通过凝胶中移动速度更快的比大的蛋白质,因此进一步下降凝胶迁移)。迁移后,凝胶放置在复性缓冲液使蛋白质,以重新获得接受高等教育的结构,酶的活性所必需的。凝胶,然后放置在一个发展中的缓冲区设计,允许蛋白酶消化其底。发展中的缓冲区也包含P - aminophenylmercuric醋酸(APMA)变为主动的基质金属蛋白酶激活非蛋白水解的基质金属蛋白酶。下一步,包括染色基板(在我们的例子明胶)。洗去多余的染料凝胶后,蛋白酶消化领域出现清晰的条带。乐队的更清晰,更集中的蛋白酶它包含。带染色强度可以通过光密度确定,如ImageJ软件使用,允许样品比较。
1。加载和运行的凝胶
2。复性和发展的凝胶
3。数据分析
4。代表性的成果
我们展示一个与不同的细胞培养上清中含有不同量的MMP - 2(图1A)的装入11井的凝胶。这种凝胶的直接观察表明在一些井之间的MMP - 2浓度明显的差异。例如,很显然,井#4和5包含得多好#11,甚至10号MMP - 2。客观量化的乐队,我们已经用ImageJ软件(图1B - D)密度测量,确认以及#11和水井#4和第5和一个约2倍的差异,在差异中MMP - 2的金额约4倍MMP - 2以及10号和水井#4和5之间的数额。
图1。明胶酶谱法检测MMP - 2。一,扫描图像明胶凝胶。井数字表明在凝胶的顶部。 B,同在一个凝胶显示在黑色和白色为光密度。每个频带被选定在ImageJ的矩形。 A和B,光密度剖面的两个例子所示凝胶(带#4和#11)。直线绘制在每个峰的基地,创建一个封闭的区域。研发,绘制峰面积为A和B前(左)后(右)正常化带#1的密度所示的凝胶。
图2这个数字演示如何酶谱可以作为一种半定量技术。我们已经加载在连续7口井连续稀释(按1:1稀释的步骤)和两个亲的MMP - 2和MMP - 2的带密度测量。
我们已经演示了如何执行zymographic分析细胞培养上清中MMP - 2的。
加载凝胶上的样品量必须根据凭经验确定的起源和MMP利益。负荷是否过小会防止检测,同时装载过多可能会导致饱和,因为只有这么多基板一种蛋白酶可以消化在乐队的领域。如果有必要,样品可以在去离子水稀释前与样缓冲液,或开发时间混合,可以减少从隔夜到4个小时。它也有可能集中在一个解决方案使用集中器(如Millipore公司目录#UFC803024)的蛋白质。如果乐队仍隐约可见,它可能是必要制定一个较长时间的凝胶,甚至长达48小时。准备从组织培养上清样品时,应当指出,胎牛血清(和其他血清)中包含的蛋白酶可以影响的结果。出于这个原因,我们收集无血清培养基培养后,我们所有的上清。
在第2.9和2.10的协议中所描述的清洗需要删除的背景染色消化乐队。洗更长的时间将删除更多的背景,但也将暗淡的基材整个凝胶染色。如果需要更长的洗涤时间是必要的,我们建议扫描凝胶每隔几个小时,选择最好的对比度扫描。
这种技术可用于检测其他的蛋白酶。例如,可以检测到MMP - 9明胶凝胶体,也程度较低的MMP - 1,MMP - 8和MMP - 13,明胶是不是他们的首选基材。 MMP - 1和MMP - 13是最好的胶原蛋白的酶谱检测,而酪蛋白是首选基板和MMP - 11也可以检测MMP - 1,MMP - 3,MMP - 7,MMP - 12和MMP - 13 9。 MMP - 7(基质溶解)和胶原酶(MMP - 1和MMP - 13)是很难检测时,在低的水平目前在酪蛋白或明胶凝胶。此外肝素样品在凝胶加载时间显着提高MMP - 7的检测限。 MMP - 1和MMP - 13,肝素需要被添加到凝胶电泳运行后已经正在进行12。
由于酶谱措施酶的活性酶的变性和复性后,它会测量所有样品中的基质金属蛋白酶的活动。这包括酶,亲酶,并绑定到内源性抑制剂的酶(如MMP - 2)。不过,可以通过比较带密度的活性酶和酶,这将有一个稍高的分子量来确定样品中的基质金属蛋白酶激活水平。
酶谱法往往是不足够的识别MMP。 MMP与已知分子量标准的迁移水平的比较,帮助识别,但应该指出,这些标准包含还原剂和非还原条件下使用时,他们可能会表示不同分子量9。一个选项是一种可溶性的重组MMP的负载测试样品相同凝胶。然而,与其他蛋白质基质金属蛋白酶可能诱导表观分子量的变化。选择性MMP抑制剂可以被添加到发展缓冲区作为药理工具孵化期间的凝胶(或部分削减了一半的凝胶)的身份interest.A第二个方法(免疫印迹,免疫细胞化学法或ELISA)MMP建议帮助鉴定MMP利益。应该指出,Western印迹检测限制通常比zymographic凝胶低得多,可能会导致假阴性结果使用这种技术时。
我们要感谢S.雷斯勒(博士,贝勒医学院分子与细胞生物学部)建议使用的蛋白质集中在细胞培养上清液中基质金属蛋白酶的浓度增加。
这个项目是由夫人祈福长老白格雷厄姆赋研究基金和美国国立卫生研究院/ NIAMS(AR059838)对CB的赠款支持。内容完全是作者的责任,并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | ||
Power supply (model 302) | VWR | 93000-744 | ||
Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | ||
Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | ||
Gel loading tips | VWR | 53509-015 | ||
Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | ||
Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | ||
Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | ||
Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | ||
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | ||
Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | ||
ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
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