Method Article
Этот протокол описывает деятельность основе анализа для выявления матриксных металлопротеиназ в культуре супернатанты или другими биологическими жидкостями.
Матрица металлопротеиназ (ММП) в цинксодержащих endopeptidases. Они ухудшают белки при расщеплении пептидных связей. Более двадцати ММП были определены и разделены на шесть групп в зависимости от их структуры и субстратной специфичности (коллагеназы, желатиназы, мембранного типа [MT-ММП], стромелизины, matrilysins, и др.). ММП играют важную роль в клеточном вторжения, хрящей деградация ткани ремоделирования, заживление ран, и эмбриогенеза. Поэтому они участвуют в нормальных процессов и в патогенезе многих заболеваний, таких как ревматоидный артрит, рак, или хроническая обструктивная болезнь легких 1-6. Здесь мы сосредоточимся на MMP-2 (желатиназа, тип IV коллагеназы), широко выразил ММП. Мы продемонстрируем, как определить, MMP-2 в супернатантах клеточных культур по zymography, обычно используется, простой и вместе с тем очень чувствительный метод впервые описан в 1980 году С. Heussen и EB Даудл 7-10. Эта методика полуколичественного, поэтому может быть использована для определения уровня ММП в опытных образцах, когда известных концентраций рекомбинантного ММП загружаются в тот же гель 11.
Растворы, содержащие ММП (например, культура клеток супернатантов, моче или сыворотке) загружаются на полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфата натрия (SDS; линеаризовать белков) и желатин (субстрат для MMP-2). Образец буфера, направленных на повышение вязкость образца (для облегчения загрузки гель), обеспечивают отслеживание красителя (бромфенола синий; следить образца миграция), обеспечить денатурации молекул (линеаризовать белков), а также контроль рН образца. Белки то разрешено мигрировать под действием электрического тока в буфере под управлением предназначен для обеспечения постоянной скорости миграции. Расстояния миграции обратно коррелирует с молекулярной массой белка (маленькие белки двигаться быстрее через гель, чем крупные белки и, следовательно, мигрировать дальше гель). После миграции геля помещается в буфер renaturing, чтобы белки, чтобы восстановить их третичной структуры, необходимые для ферментативной активности. Гель помещается в буфер развивающихся разработаны, чтобы позволить протеазы переварить ее субстратом. Развивающихся буфера также содержит р-aminophenylmercuric ацетат (APMA), чтобы активировать без протеолитических про-ММП в активные ММП. Следующий шаг заключается в окрашивании субстрата (желатин в нашем примере). После мытья избыток красителя с гелем, области протеазы пищеварения появляются как ясно полосы. Четкие группы, более концентрированный протеазы в нем содержится. Интенсивность окрашивания Группа может быть определена денситометрии, используя такие программы, как ImageJ, что позволяет для образца сравнения.
1. Загрузка и запуск Гель
2. Renaturing и развитие Гель
3. Анализ данных
4. Представитель Результаты
Мы показываем, гель с 11 скважин загружены различные культуры клеток супернатантов с различным содержанием ММП-2 (рис. 1А). Прямое наблюдение этого геля показывает очевидные различия в MMP-2 концентрации между некоторыми из скважин. Например, ясно, что скважины № 4 и 5 содержат намного больше MMP-2, чем скважины № 11 или даже скважины № 10. Для объективной количественной полос мы использовали денситометрии с помощью программного обеспечения ImageJ (рис. 1В-D), подтверждающие около 4-кратную разницу в MMP-2 сумму от скважины № 11 и скважины № 4 и 5, и около 2-кратную разницу в ММП-2 сумму от скважины № 10 и скважины № 4 и 5.
Рисунок 1. Обнаружение MMP-2 с помощью желатина zymography. , Отсканированное изображение желатин геля. Ну номера указаны в верхней части геля. B, тот же гель, как в показано в черно-белый для денситометрии. Каждая группа была выбрана с прямоугольником в ImageJ. С, Два примера денситометрии профили для геля показано в А и В (полосы № 4 и № 11). Прямая линия была нарисована в основе каждого пика создать замкнутую область. D, земельный площадей пиков для геля показано в А и В до (слева) и после (справа) нормализация к плотности группы № 1.
Рисунок 2. Эта цифра демонстрирует, как zymography может быть использован как полуколичественного техники. Мы загрузили серийные разведения (шаги 1:1, разведения) в 7 последовательных колодцев и измеряется группы плотности для обоих про-ММП-2 и MMP-2.
Мы показали, как выполнять zymographic анализа ММП-2 в супернатантах клеточных культур.
Количество пробы, чтобы нагрузка на гель должен быть определен эмпирически в зависимости от происхождения и ММП интересов. Загрузка слишком мало будет препятствовать обнаружению при загрузке слишком много, может привести к насыщению, так как есть только в той субстрата протеазы может переварить в области полосы. При необходимости, образец можно развести в деионизированной воды до смешивания с загрузкой буфера или развивающиеся времени может де снижена с ночи до 4 часов. Кроме того, можно сосредоточиться белков в решение с использованием концентраторов (например, Millipore каталога # UFC803024). Если полосы остаются едва заметные, это может быть необходимо разработать гели для более длительного периода времени, вплоть до 48 часов. При подготовке проб из супернатантов культур тканей, следует отметить, что эмбриональной телячьей сыворотки (и других сывороток) содержит ММП, которые могут повлиять на результаты. По этой причине, мы собираем все наши супернатантов после культуру в свободной от сыворотки среде.
Моет, описанных в пунктах 2.9 и 2.10 протокола необходимо, чтобы удалить фон окрашивание переваривается полосы. Более мыть раз удалит больше фона, но и тусклый окрашивания подложки всей геля. Если более длительное время мытья необходимо, мы рекомендуем сканирования геля каждые несколько часов, чтобы выбрать сканирование с лучшей контрастностью.
Этот метод может быть использован для обнаружения других ММП. Например, MMP-9 могут быть обнаружены на желатин гелей, а также в меньшей степени MMP-1, MMP-8 и ММР-13 как желатин не является их предпочтительным субстратом. MMP-1 и ММР-13 лучше обнаружены на коллаген zymography в то время как казеин является предпочтительным субстратом для MMP-11, а также позволяет для обнаружения MMP-1, MMP-3, ММР-7, MMP-12 и ММР-13 9. MMP-7 (matrilysin) и коллагеназы (MMP-1 и MMP-13), трудно определить, когда присутствовал на низком уровне в казеин или желатин гели. Добавление гепарина к образцу во время загрузки гель значительно повышает предел обнаружения для MMP-7. Для MMP-1 и MMP-13, гепарина должна быть добавлена, чтобы гель после электрофоретического запустить уже идет 12.
С zymography меры ферментативную активность после денатурации и ренатурации ферментов, она будет измерять активность всех ММП присутствуют в образце. Они включают в себя ферменты, про-ферменты и ферменты, связанные с эндогенными ингибиторами (например, TIMP-2). Это, однако, можно определить уровень ММП активации в образец, сравнивая группы плотность активного фермента и, что про-фермента, который будет иметь немного более высоким молекулярным весом.
Zymography часто недостаточно для выявления ММП. Сравнение миграции уровня ММП с известным молекулярным весом стандарты действительно помогает в идентификации, но следует отметить, что некоторые из этих стандартов содержат восстановителем и что когда он используется в невосстанавливающих условиях они могут указывать на различные молекулярные массы 9. Опция для загрузки растворимых рекомбинантных ММП на том же геля в качестве тест-образцов. ММП, однако, может быть связан с другими белками, вызывая изменение молекулярной массы. Селективные ингибиторы MMP могут быть добавлены в гель (или его часть геля разрезать пополам) во время инкубации в развивающихся буфер фармакологических средств для личности ММП из interest.A Второй метод (Вестерн блот, иммуноцитохимия, или ИФА), рекомендуется помощь в идентификации ММП интересов. Следует отметить, что пределы обнаружения для Западной Блоты зачастую гораздо ниже, чем у zymographic гели, что может привести к ложно-отрицательных результатов при использовании этой техники.
Мы хотели бы поблагодарить д-р С. Ресслер (Отдел молекулярной и клеточной биологии Медицинского колледжа Бэйлора), предложившего использовать белка концентраторы увеличить концентрацию ММП в супернатантах клеточных культур.
Этот проект был поддержан грантами от миссис Клиффорд старейшина Белый Грэм Наделенный Фонда исследований и NIH / NIAMS (AR059838) к ЦБ. Содержание несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения NIH.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | ||
Power supply (model 302) | VWR | 93000-744 | ||
Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | ||
Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | ||
Gel loading tips | VWR | 53509-015 | ||
Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | ||
Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | ||
Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | ||
Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | ||
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | ||
Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | ||
ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены