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Este protocolo descreve um ensaio baseado em atividades para a detecção de metaloproteinases de matriz em sobrenadante de cultura ou fluidos corporais.
Metaloproteinases de matriz (MMPs) são endopeptidases contendo zinco. Eles degradam proteínas por clivagem de ligações peptídicas. Mais de vinte MMPs foram identificados e são separados em seis grupos com base em sua estrutura e especificidade de substrato (colagenases, gelatinases, tipo de membrana [MT-MMP], estromelisinas, matrilisinas, e outros). MMPs desempenham um papel crítico na invasão celular, a degradação da cartilagem, remodelação do tecido, cicatrização de feridas, e embriogênese. Eles, portanto, participar em ambos os processos normais e na patogênese de muitas doenças, como artrite reumatóide, câncer ou doença pulmonar obstrutiva crônica 1-6. Aqui, vamos nos concentrar em MMP-2 (gelatinase A, colagenase tipo IV), a MMP amplamente expressa. Vamos demonstrar como detectar MMP-2 em sobrenadante de cultura de células por zimografia, uma técnica comumente usada, simples, e ainda assim muito sensível descrita pela primeira vez em 1980 por C. Heussen e Dowdle EB 7-10. Esta técnica é semi-quantitativo, portanto pode ser usada para determinar os níveis de MMP em amostras de teste quando concentrações conhecidas de MMP recombinante são carregados no mesmo gel 11.
Soluções contendo MMPs (por exemplo, sobrenadantes de cultura de células, urina ou soro) são carregados em um gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS, para linearizar as proteínas) e gelatina (substrato para a MMP-2). O tampão de amostra é projetado para aumentar a viscosidade da amostra (para facilitar o carregamento gel), fornecem um corante de rastreamento (azul de bromofenol, para monitorar a migração da amostra), fornecem moléculas de desnaturação (para linearizar proteínas), e controlar o pH da amostra. Proteínas são, então, permissão para migrar sob uma corrente elétrica em um tampão de corrida projetado para fornecer uma taxa de migração constante. A distância de migração é inversamente correlacionada com o peso molecular da proteína (pequenas proteínas se movem mais rapidamente através do gel de proteínas e, portanto, fazer grandes migrar ainda mais para baixo do gel). Após a migração, o gel é colocado em um buffer renaturing para permitir que as proteínas para recuperar a sua estrutura terciária, necessárias para a atividade enzimática. O gel é então colocada em um buffer de desenvolvimento concebido para permitir a protease para digerir seu substrato. O buffer de desenvolvimento também contém p-aminophenylmercuric acetato (APMA) para ativar a não proteolíticos pró-MMPs em MMPs ativas. O próximo passo consiste em manchar o substrato (gelatina no nosso exemplo). Depois de lavar o excesso de corante fora do gel, as áreas de digestão protease aparecem como faixas claras. Quanto mais clara a banda, mais concentrada a protease que ele contém. Intensidade de coloração da banda pode ser determinada por densitometria, utilizando um software, como ImageJ, permitindo a comparação da amostra.
1. Carregando e executando o Gel
2. Renaturing e Desenvolvimento do Gel
3. Análise de Dados
4. Resultados representante
Mostramos um gel com 11 poços carregado com sobrenadantes de células diferentes de cultura contendo diferentes quantidades de MMP-2 (Figura 1A). Observação direta deste gel mostra diferenças óbvias em MMP-2 concentrações entre alguns dos poços. Por exemplo, fica claro que os poços # 4 e 5 contêm muito mais MMP-2 do que bem # 11 ou até mesmo bem # 10. Para a quantificação objetivo de bandas que têm usado com o software de densitometria ImageJ (Figura 1B-D), confirmando uma diferença de cerca de 4 vezes na MMP-2 montantes entre bem # 11 e # poços 4 e 5 e uma diferença de aproximadamente 2 vezes na MMP-2 montantes entre bem # 10 e # poços 4 e 5.
Figura 1. Detecção de MMP-2 por zimografia gelatina. Uma imagem, digitalizada de um gel de gelatina. Números são bem indicado na parte superior do gel. B gel, mesmo que em um mostradas em preto e branco para a densitometria. Cada banda foi selecionada com um retângulo no ImageJ. C, dois exemplos de perfis de densitometria para o gel mostrado em A e B (bandas # 4 e # 11). Uma linha reta foi traçada na base de cada pico para criar uma área fechada. D, Lote das áreas de pico para o gel mostrado em A e B antes (esquerda) e após a normalização (direita) para a densidade da banda # 1.
Figura 2. Esta figura demonstra como zimografia pode ser usado como uma técnica semi-quantitativa. Temos carregado diluições em série (passos de 1:1 diluições) em 7 poços consecutivos e mediram a densidade de banda para os dois pró-MMP-2 e MMP-2.
Nós demonstramos como realizar análise zymographic de MMP-2 em sobrenadante de cultura de células.
A quantidade de amostra para carregar em um gel deve ser determinada empiricamente, dependendo da origem e MMP de interesse. Carregamento muito pouco vai impedir a detecção ao carregar demais pode levar à saturação como há substrato somente tanto uma protease pode digerir na área da banda. Se necessário, a amostra pode ser diluída em água deionizada antes da mistura com tampão de carregamento ou o tempo de desenvolvimento podem reduzido de overnight a 4 horas. Também é possível concentrar as proteínas em uma solução utilizando concentradores (por exemplo, catálogo Millipore # UFC803024). Se bandas permanecem pouco visíveis, pode ser necessário para desenvolver o gel por um longo período de tempo, até um máximo de 48 horas. Ao preparar as amostras de sobrenadantes de cultura de tecido, deve-se notar que o soro fetal bovino (e outros soros) contém MMPs que podem afetar os resultados. Por essa razão, coletamos todos os nossos sobrenadantes após cultura em meio livre de soro.
As lavagens descritos nos parágrafos 2.9 e 2.10 do protocolo são necessárias para remover o fundo de coloração de bandas digeridas. Vezes mais lavar irá remover mais fundo, mas também dim a coloração do substrato ao longo do gel. Se lavar mais vezes são necessárias, recomendamos a varredura do gel a cada poucas horas para selecionar o scan com o melhor contraste.
Esta técnica pode ser utilizada para detectar outras MMPs. Por exemplo, MMP-9 pode ser detectado em gel de gelatina, e também em menor escala MMP-1, MMP-8 e MMP-13 como a gelatina não é o seu substrato preferencial. MMP-1 e MMP-13 são melhor detectadas em zimografia colágeno, enquanto a caseína é o substrato preferido para a MMP-11 e também permite a detecção de MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 e MMP-13 9. MMP-7 (matrilisina) e colagenases (MMP-1 e MMP-13) são difíceis de detectar quando presente em níveis baixos em caseína ou géis de gelatina. Adição de heparina ao exemplo em tempo de carregamento gel melhora significativamente o limite de detecção para MMP-7. Para MMP-1 e MMP-13, a heparina deve ser adicionado ao gel após a corrida eletroforética já está em andamento 12.
Desde zimografia medidas atividade enzimática após desnaturação e renaturação das enzimas, ele irá medir a atividade de todas as MMPs presentes na amostra. Isto inclui as enzimas, pró-enzimas, enzimas e obrigado a inibidores endógenos (por exemplo, TIMP-2). No entanto, é possível determinar o nível de ativação MMP na amostra, comparando a densidade da banda da enzima ativa e do da pró-enzima, que terá um peso molecular um pouco maior.
Zimografia muitas vezes não é suficiente para identificar uma MMP. Comparação do nível de migração de uma MMP com conhecidos padrões de peso molecular não ajuda na identificação, mas deve-se notar que algumas dessas normas contêm um agente redutor e que, quando usado sob condições não-redução que pode indicar diferentes pesos moleculares 9. Uma opção é carregar um MMP solúvel recombinante no mesmo gel que as amostras de teste. MMPs pode, contudo, ser associado com outras proteínas, induzindo uma mudança no peso molecular aparente. Inibidores seletivos MMP pode ser adicionado ao gel (ou parte de um corte pela metade gel) durante a incubação em tampão desenvolvimento como ferramentas farmacológicas para a identidade do MMP de interest.A segunda técnica (Western Blot, imunocitoquímica, ou ELISA) é recomendada para ajudar na identificação da MMP de interesse. Note-se que os limites de detecção para Western Blot são frequentemente muito inferiores aos dos géis zymographic, podendo levar a resultados falso-negativos quando se usa esta técnica.
Gostaríamos de agradecer ao Dr. S. Ressler (Departamento de Biologia Molecular e Celular, Baylor College of Medicine) para sugerir o uso de proteína concentradores para aumentar a concentração de MMPs em sobrenadante de cultura de células.
Este projeto foi suportado por concessões do Elder Clifford Sra. White Graham Fundo de Investigação Dotado eo NIAMS NIH / (AR059838) para CB. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do NIH.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | ||
Power supply (model 302) | VWR | 93000-744 | ||
Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | ||
Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | ||
Gel loading tips | VWR | 53509-015 | ||
Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | ||
Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | ||
Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | ||
Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | ||
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | ||
Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | ||
ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
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