גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

Summary

פרוטוקול זה מתאר assay פעילות מבוססי לאיתור metalloproteinases מטריקס supernatants תרבות או נוזלי גוף.

Abstract

Metalloproteinases מטריקס (MMPs) הם אבץ המכיל endopeptidases. הם לבזות חלבונים על ידי המחשוף של אג"ח פפטיד. יותר מעשרים MMPs זוהו מופרדות לשש קבוצות על בסיס המבנה שלהם ואת המצע סגוליות (collagenases, gelatinases, סוג קרום [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, ואחרים). MMPs לשחק תפקיד קריטי בפלישה התא, השפלה סחוס, שיפוץ רקמות, ריפוי פצעים, ועל העובר. לכן הם להשתתף בשני תהליכים נורמליים בפתוגנזה של מחלות רבות, כגון דלקת מפרקים שגרונית סרטן, או מחלת ריאות חסימתית כרונית ^1-6. כאן נתמקד MMP-2 (gelatinase, סוג IV collagenase), MMP ביטוי נרחב. אנו מדגימים כיצד לזהות MMP-2 ב supernatants תרבית תאים על ידי zymography, נפוץ, טכניקה פשוטה, ובכל זאת מאוד רגיש שתוארה לראשונה על ידי ג Heussen ו EB דאודל ^7-10 בשנת 1980. טכניקה זו היא חצי כמותית, ולכן הוא יכול לשמש כדי לקבוע רמות MMP בדגימות מבחן כאשר הריכוזים הידועים של MMP רקומביננטי נטענים על ג'ל אותו ^11.

פתרונות המכיל MMPs (למשל תרבית תאים supernatants, שתן, או בסרום) נטענים ג'ל polyacrylamide המכיל נתרן גופרתי dodecyl (SDS, כדי linearize את החלבונים) ו ג'לטין (המצע של MMP-2). חיץ מדגם נועד להגביר צמיגות מדגם (כדי להקל על טעינת ג'ל), לספק צבע מעקב (כחול bromophenol; לפקח הגירה לדוגמה), לספק מולקולות denaturing (עד linearize חלבונים), וכן לשלוט על ה-pH של המדגם. חלבונים מותר אז להעביר תחת זרם חשמלי במאגר ריצה נועד לספק קצב העברה קבוע. המרחק של הגירה היא בקורלציה הפוכה עם משקל מולקולרי של החלבון (חלבונים קטנים לנוע מהר יותר מאשר באמצעות ג'ל חלבונים גדולים לעשות ולכן להגר בהמשך הג'ל). לאחר ההגירה, הג'ל מושם חיץ renaturing לאפשר חלבונים להחזיר מבנה שלישוני שלהם, הדרושים הפעילות האנזימטית. הג'ל מושם אז חיץ בפיתוח נועד לאפשר פרוטאז לעכל את המצע שלה. המאגר מכיל גם בפיתוח p-aminophenylmercuric אצטט (APMA) כדי להפעיל את הלא proteolytic הפרו MMPs לתוך MMPs פעיל. הצעד הבא מורכב מכתים את המצע (ג'לטין בדוגמה שלנו). לאחר שטיפת צבע עודף את הג'ל, תחומי העיכול פרוטאז יופיעו להקות ברור. ברור הלהקה, מרוכז יותר פרוטאז שהוא מכיל. מכתים עוצמת בנד אז יכול להיות נקבע על פי צפיפות, באמצעות תוכנה כגון ImageJ, המאפשרות השוואה המדגם.

Protocol

1. טוען והפעלה של ג'ל האלו ורה

1. כל הדגימות חייב להיות מוכן כראוי כדי לשמור על תפקוד האנזימים בשימוש מיד לאחר איסוף או מאוחסנים קפוא ב -80 ° C. דוגמאות לא חייב להכיל סוכני צמצום (כגון β-mercaptoethanol) או להרתיח לפני טעינת ג'ל.
2. פתח את שקיק המכיל ג'ל בתוך קלטת, יש לשטוף את הקלטת עם מים deionized.
   • הסר את הסרט המגן מהחלק התחתון של הקלטת ואת מסרק מהחלק העליון של הג'ל.
   • לשטוף שלוש פעמים בארות עם חיץ ריצה (מדולל במים כדי 1X deionized).
   • מניחים את הג'ל לתוך תא ה-Mini-, להבטיח כי הצד קטן יותר של קלטת הפנים פנימה. נעל למקום עם וודג את המתח ג'ל. ה-Mini-Cell מאפשרת להריץ אחד או שניים ג'לים במקביל.
   • ממלאים את החדר העליון (בפנים) עם חיץ 1X פועל מעל פני בארות, לבדוק אם קיימת דליפה כלשהי. במקרה של דליפה, להסיר את החיץ למקם את הג'ל.
   • ממלאים את החדר התחתון עם חיץ 1X פועל.
3. טען 10 μL של חלבון סמן מולקולרי אחד טוב.
   • לערבב כמות שווה של חיץ ג'ל העמסה של מדגם לטעון לתוך הבארות של ג'ל בעזרת ג'ל טעינת טיפים (השתנה בין כל דגימה). בארות אלה יכולים להיות עמוסים עד לסך 20 μL.
4. מניחים את המכסה על תא ה-Mini-ולחבר את מיתרי אלקטרודה לאספקת חשמל. החלף את אספקת החשמל על ולהגדיר אותו לרוץ 125 V קבוע במשך 90 דקות. בדוק את היווצרות של בועות קטנות על חוט של החדר התחתון, המציין במחזור הנוכחי.
5. בעת הרצת הג'ל הראשון שלך, לעקוב אחר ההתקדמות של הגירה כל 15 דקות, באמצעות כחול bromophenol כלול למאגר טעינת אינדיקטור. תנו לרוץ ג'ל עד צבע אינדיקטור מגיע לתחתית הג'ל.

2. Renaturing ופיתוח ג'ל

1. עבור כל ג'ל, להכין 100 מ"ל של חיץ 1X renaturing ו -200 מ"ל של denaturing חיץ, הן מים deionized.
2. כאשר צבע bromophenol מעקב כחול מגיע לתחתית הג'ל, לעבור את אספקת החשמל כבוי, לפתוח את תא מיני, ולהסיר את הג'ל. הפרד את שני הצדדים של הקלטת באמצעות סכין ג'ל (או מרית במשקל). גזור פינה כדי לסמן כיוון של ג'ל.
3. הסר בזהירות את הג'ל מתוך קלטת והמקום לתוך מיכל עם חיץ renaturing 100 מ"ל. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
4. הסר את חוצץ renaturing ולהוסיף 100 מ"ל של פיתוח המאגר על הג'ל. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
5. הסר את חוצץ בפיתוח להוסיף 100 מ"ל יותר חיץ מתפתחות הג'ל. דגירה לילה (16-18 שעות) בשעה 37 ° C.
6. הסר את חוצץ בפיתוח לשטוף שלוש פעמים (5 דקות כל אחד) עם מים deionized תחת תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר.
7. סרוק את הג'ל להציל את המיקום המדויק של להקות תקן חלבון כפי שהם יהיו פחות או אינם גלויים לאחר צביעת הג'ל.
8. הכתם ג'ל על ידי הוספת 20 מ"ל של SimplyBlue Safestain על הג'ל. דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה.
9. הסר את SafeStain SimplyBlue ו-de הכתם ג'ל 100 מ"ל מים או deionized יותר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה.
10. לקבלת תוצאות טובות יותר, להחליף מים deionized דגירה טרי עוד שעה או יותר בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה.

3. ניתוח נתונים

1. הסר בזהירות את הג'ל מהמים ומניחים מגן יריעת פלסטיק.
2. סרוק את הג'ל עם רזולוציה של 300 dpi ומעלה. שמור את התמונה בפורמט TIFF (איור 1 א).
3. מדידת עוצמות הלהקה עם ImageJ (או תוכנה דומה אחרת).
   • פתח את קובץ TIFF ב ImageJ (איור 1A).
   • דמיינו בשחור לבן על ידי בחירת "תמונה> סוג> 8 סיביות" (איור 1B).
   • השתמש בכלי בחירה מלבני מתאר את הלהקה הראשונה, ציור מלבן לפחות פעמיים גבוה יותר מאשר זה הוא רחב (זוהי דרישה תוכנה).
   • הקש "1" או לבחור "נתח> ג'ל> בחר מסלול ראשון" הלהקה יפורטו.
   • מלבן חדש יופיע, להעביר אותה הלהקה בא ונבחר "נתח> ג'ל> בחר בנתיב הבא". חזור על הפעולה עד שכל הלהקות שנבחרו (איור 1B).
   • לחצו על "3" או לבחור "נתח> ג'ל> נתיבי מגרש" כדי ליצור את העלילה פרופיל עבור כל הלהקה (תרשים 1C).
   • השתמש הבחירה בקו ישר (צריך להיות כבר נבחר אוטומטית) כדי לצייר קווים בסיס כך שיא של עניין הוא אזור סגור לחלוטין.
   • בחרו בכלי מטה ולחץ בתוך כל שיא כדי לבחור בו.
   • בחר "נתח> ג'ל> פסגות לייבל" להשיג שולחן עם אזור השיא עבור כל נבחרת. נתונים אלה ניתן להתוות ככזה (F1D igure) או יכול להיות מנורמל לערך של הלהקה שנבחר. נורמליזציה זה חשוב במיוחד כאשר איחוד ערכים ג'לים לשכפל מספר כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית של התוצאות.

4. נציג תוצאות

אנחנו מראים ג'ל עם 11 בארות עמוסה שונה תרבות supernatants התא המכיל כמויות שונות של MMP-2 (איור 1 א). תצפית ישירה של ג'ל זה מראה הבדלים ברורים MMP-2 ריכוזים בין כמה בארות. לדוגמה, ברור כי בארות # 4 ו -5 מכילים הרבה יותר MMP-2 # 11 טוב יותר, או אפילו טוב # 10. עבור כימות אובייקטיבי של להקות השתמשנו צפיפות עם התוכנה ImageJ (איור 1B-D), המאשר את ההבדל כ -4 של פי MMP-2 כמויות בין טוב # 11 ובארות # 4 ו 5 ו כ -2 הפרש של פי MMP-2 כמויות בין טוב # 10 ובארות # 4 ו -5.

באיור 1. איתור של MMP-2 על ידי zymography ג'לטין. התמונה, סרוקות של ג'ל ג'לטין. ובכן המספרים מצוינים בחלק העליון של הג'ל. B, ג'ל זהה המוצג בשחור לבן של צפיפות. הלהקה נבחרה עם כל מלבן ב ImageJ. C, שתי דוגמאות של פרופילים עבור צפיפות ג'ל המוצג A ו-B (להקות # 4 ו - # 11). קו ישר נמשך בבסיס שיא כל ליצור שטח סגור. ד ', מגרש האזורים השיא ג'ל המוצג נורמליזציה A ו-B (מימין) לפני (משמאל) לאחר לצפיפות של הלהקה מס' 1.

איור 2. נתון זה מדגים כיצד zymography יכול לשמש טכניקה וכמותיות. יש לנו טעון דילולים סדרתי (מדרגות 01:01 דילולים) ב -7 בארות רצופים מדדו את צפיפות הלהקה הן הפרו MMP-2 ו - MMP-2.

Discussion

אנחנו הדגימו כיצד לבצע ניתוח zymographic של MMP-2 ב supernatants תרבית תאים.

כמות המדגם כדי לטעון את הג'ל צריכה להיקבע באופן אמפירי בהתאם למקור ו MMP ​​של עניין. טעינת מעט מדי ימנע גילוי בעת טעינת מדי עלול להוביל הרוויה כפי שיש כל כך הרבה רק המצע פרוטאז יכולים לעכל באזור של הלהקה. במידת הצורך, את המדגם יכול להיות מדולל במים deionized לפני ערבוב עם חיץ העמסה או הזמן לפתח יכולות מופחת דה מן לילה עד 4 שעות. אפשר גם לרכז חלבונים בתמיסה באמצעות ריכוז (למשל קטלוג Millipore # UFC803024). אם להקות להישאר בקושי נראה, זה עשוי להיות נחוץ כדי לפתח את הג'לים לתקופה ארוכה של זמן, אפילו עד 48 שעות. בעת הכנת דגימות supernatants בתרבית רקמה, יש לציין כי בסרום שור העובר (וסרה אחרים) מכיל MMPs שיכולים להשפיע על התוצאות. מסיבה זו, אנו אוספים את כל supernatants שלנו לאחר התרבות בינוני בסרום חינם.

שוטף המתוארים בסעיפים 2.9 ו - 2.10 של פרוטוקול נחוצים כדי להסיר את הרקע מכתים של להקות מעוכל. פעמים לשטוף ארוכים תסיר את הרקע יותר, אבל יהיו גם כתמים עמומים של המצע לאורך הג'ל. אם כבר לשטוף פעמים יש צורך, מומלץ לסרוק את הג'ל כל כמה שעות כדי לבחור את הסריקה עם ניגודיות את הטוב ביותר.

טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות MMPs אחרים. לדוגמה, MMP-9 ניתן להבחין על ג'לים ג'לטין, וגם במידה נמוכה MMP-1, MMP-8, ו - MMP-13 כמו ג'לטין אינו המצע המועדף עליהם. MMP-1 ו - MMP-13 מזוהים הטוב ביותר zymography קולגן תוך קזאין הוא המצע המועדף MMP-11 וגם מאפשר זיהוי של MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12, ו - MMP-13 ^9. MMP-7 (matrilysin) ו collagenases (MMP-1 ו - MMP-13) קשה לזהות כאשר נוכח רמות נמוכות של קזאין או ג'לים ג'לטין. תוספת של הפרין המדגם בזמן הטעינה ג'ל משפר באופן משמעותי את גבול הגילוי של MMP-7. עבור MMP-1 ו-MMP-13, הפרין צריך להוסיף ג'ל לאחר ריצה electrophoretic כבר בעיצומן ^12.

מאז zymography אמצעים הפעילות האנזימטית לאחר denaturation ו renaturation של אנזימים, זה יהיה למדוד את הפעילות של כל MMPs הנוכחית במדגם. זה כולל אנזימים, הפרו אנזימים, ואנזימים חייב מעכבי אנדוגני (למשל TIMP-2). זה אפשרי אך כדי לקבוע את רמת ההפעלה MMP במדגם על ידי השוואת צפיפות הלהקה של האנזים פעיל מזה של הפרו האנזים, אשר יהיה בעל משקל מולקולרי גבוה מעט יותר.

Zymography הוא לעתים קרובות לא מספיק כדי לזהות MMP. השוואה של רמת ההגירה של MMP עם ידוע סטנדרטים משקל מולקולרי עוזר בזיהוי אך יש לציין כי חלק תקנים אלה מכילים סוכן צמצום וכי כאשר נעשה שימוש תחת אי - הפחתת התנאים הם עשויים להצביע משקולות מולקולריים שונים ^9. אופציה היא לטעון MMP מסיס רקומביננטי על ג'ל זהה דגימות הבדיקה. MMPs עשויה להיות קשורה אך עם חלבונים אחרים, גרימת שינוי משקל מולקולרי לעין. מעכבי MMP סלקטיבי ניתן להוסיף ג'ל (או חלק לחתוך ג'ל במחצית) במהלך הדגירה של חיץ ככלים לפיתוח תרופתי זהות MMP של הטכניקה interest.A השני (המערבי כתם, immunocytochemistry, או ELISA) מומלץ עזרה בזיהוי של MMP של עניין. יצוין, כי מגבלות זיהוי כתמים המערבי הם לעתים קרובות נמוכים בהרבה מאלה של ג'לים zymographic, שעלול כדי שווא שלילי תוצאות בעת שימוש בטכניקה זו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus	Invitrogen	EI0001
Power supply (model 302)	VWR international	93000-744
Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells	Invitrogen	EC61752BOX
Blue Juice gel loading buffer	Invitrogen	10816015
Gel loading tips	VWR international	53509-015
Protein molecular weight standard	Invitrogen	LC5800
Novex Tris-Glycine-SDS running buffer	Invitrogen	LC2675
Novex zymogram renaturing buffer	Invitrogen	LC2670
Novex zymogram developing buffer	Invitrogen	LC2671
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Epson Perfection 4490 Photo Scanner	Amazon	n/a
ImageJ software	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH