عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين

Summary

نحن تصف طريقة لتحضير شرائح الحصين عضوي النمط التي يمكن تكييفها بسهولة إلى مناطق أخرى من الدماغ. وضعت شرائح الدماغ على الأغشية التي يسهل اختراقها وسائل الاعلام الثقافة يسمح له شكل واجهة. هذا الأسلوب يحافظ على بنية الإجمالي للقرن آمون لمدة تصل الى 2 أسابيع في الثقافة.

Abstract

قرن آمون ، وهو مكون من الجهاز الحوفي ، ويلعب دورا هاما في الذاكرة طويلة المدى والملاحة الفضائية ^1. يمكن أن الخلايا العصبية الحصين تعديل قوام صلاتهم بعد فترات وجيزة من تفعيل قوي. ويمكن لهذه الظاهرة ، والمعروفة باسم بعيدة المدى (الكمونية) تستمر لساعات أو أيام ، وأصبحت آلية أفضل مرشح للتعلم والذاكرة ^2. بالإضافة إلى ذلك ، بذلت التشريح محددة جيدا ، والتواصل بين الحصين ³ أنه نظام نموذجي لدراسة نقل الكلاسيكية متشابك ومتشابك ⁴ اللدونة.

كما فهمنا للعلم وظائف الأعضاء من نقاط الاشتباك العصبي الحصين نما وأصبح اللاعبون الجزيئية التي تم تحديدها ، وأصبح من الضروري التعامل مع البروتينات متشابك حتمية. ثقافات الحصين عضوي النمط توفر إمكانية للتلاعب الجيني سهلة ودقيقة ولكن التدخل الدوائي الحفاظ على منظمة متشابك التي تعتبر ضرورية لفهم وظيفة المشبك في سياق طبيعي أكثر من الأساليب الروتينية ثقافة فصل الخلايا العصبية.

هنا نقدم طريقة لتحضير شرائح الحصين والثقافة التي يمكن تكييفها بسهولة إلى مناطق أخرى من الدماغ. هذا الأسلوب يتيح سهولة الوصول إلى شرائح للتلاعب الجيني باستخدام أساليب مختلفة مثل العدوى الفيروسية أو ^5،6 biolistics ^7. بالإضافة ، يمكن استردادها بسهولة لشرائح فحوصات البيوكيميائية ⁸ ، أو نقلها إلى المجاهر التصوير ⁹ أو ¹⁰ تجارب الكهربية.

Protocol

1. قبل البدء في إعداد شرائح الحصين.

1. إعداد تقطيع الأنسجة عن طريق وضع قطعة من ورقة تفلون وتصاعد شفرة جديدة.
2. مسح نسيج الثقافة (TC) هود مع الايثانول 70 ٪ ومجموعة الداخل مجهر تشريح. تعقيم هود ، المجهر ، وتقطيع اللحم والأنسجة وتشريح جميع الصكوك لمدة 15 دقيقة للأشعة فوق البنفسجية.
3. إعداد ست لوحات TC جيدا. إضافة 750 ميكرولتر ثقافة شريحة وسائل الإعلام (SCM) في مكان جيد وإدراج ثقافة خلية في كل بئر. تأكد من الأغشية الرطبة تماما مع عدم وجود فقاعات تحتها. وضع لوحات في حاضنة على 35 درجة مئوية بالغاز مع 5 ٪ CO ₂ لحين الحاجة إليها.
4. صب 50 مل ⁺ ACSF منخفضة نا (تشريح الحل) في كوب 100 مل ووضعه على الجليد الملح المزيج. فقاعة المنخفض الصوديوم ⁺ ACSF مع 5 ٪ CO ₂ / 95 ٪ O ₂ حتى يتغير لونها وACSF أشكال مزيج من الطين حل المجمدة والسائلة (10-20 دقيقة).
5. الحصول على الفئران P5 - P7 الجرو. ويمكن استخدام ما يصل الى ثلاثة الجراء.

2. الحصين شرائح التحضير.

1. قطع رأس الحيوان مع مقص أداة حادة. قطع الجلد وفضح الجمجمة. فتح الجمجمة عن طريق قطع من جانب إلى آخر على طول خط interaural ومن ثم على طول الدرز السهمي مع مقص صغير. ويمكن إجراء خفض اختياري من جانب إلى آخر في الجبهة لتسهيل إزالة العظام والتعرض للدماغ. يستخرج الدماغ بسرعة مع ملعقة ملعقة صغيرة مدورة ووضعه في الطين من تشريح حل البرد لمدة دقيقة 1 ~. ~ صب 10 مل من محلول الباردة الجليد تشريح على طبق 60 ملم ونقل الدماغ من الدورق إلى الطبق. ينبغي تغطية تشريح الدماغ مع الحل.
2. تحت المجهر تشريح : ضع الدماغ والاحتفاظ بها في خط الوسط مع ملقط تشريح الضغط إلى أسفل الطبق 60 ملم. استخدام أداة تشريح الحصين للفصل بين نصفي الكرة الأرضية تاركة الدماغ المتوسط. ويتعرض بعد ذلك الحصين على كل الكرة الأرضية. ثم بلطف الحصين مغرفة بها مع تشريح الحصين الأداة. استخدام إبرة تشريح لعزل تماما الحصين وتنظيفه قدر المستطاع.
3. استخدام غيض مقصوص من طرف P1000 ماصة التصفية ، نضح بلطف الحصين وتحويلها إلى ورقة تفلون على تقطيع اللحم والأنسجة. موقف الحصين على جانبها مقعرة.
4. محاذاة عمودية الحصين لنصل للحصول على مقاطع الاكليلية واستنزاف فائض السائل.
5. الحصين كل شريحة ميكرون 400.
6. ~ صب 10 مل الباردة المجلس الاعلى للقضاة في صحن 60 ملم ونقل شرائح الحصين من تقطيع اللحم وباستخدام آخر مقصوص P1000 طرف مرشح المجلس الاعلى للقضاة والباردة. تجنب جعل فقاعات.
7. مع مساعدة من ملعقة ملعقة والقزحية مباشرة منفصلة بلطف شرائح من بعضها البعض.
8. شرائح منفصلة واضحة المعالم وغير التالفة من الشرائح المتضررة.

3. الحصين شرائح الثقافة

1. تقديم لوحات ستة جيدا مع المجلس الاعلى للقضاة وإدراج ثقافة خلية من الحاضنة. مع مساعدة من طرف آخر P1000 مقصوص تصفية ونقل الشرائح الفردية على الغشاء. مكان شرائح 4-5 في الغشاء. يجب الحرص على عدم وضع الشرائح وثيقة إما إلى الجدار إدراج أو قريبة من بعضها البعض. عند الضرورة ، واستخدام ملعقة لقزحية شرائح منفصلة. إزالة الزائدة المتوسطة. شرائح اتصال أقل قدر ممكن مرة واحدة كانت على الغشاء.
2. تحرك الصفيحة العودة إلى الحاضنة والثقافة في 35 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.
3. SCM تغيير كل 48 ساعة داخل غطاء TC بواسطة الشفط مع المجلس الأعلى للقضاء ماصة باستور. إضافة 750 ميكرولتر من قبل المجلس الاعلى للقضاة تحسنت جديدة لكل بئر. تأكد من أن يتم تشكيل أي فقاعات تحت الغشاء.

4. الحلول

1. انخفاض الصوديوم ⁺ ACSF -- حل تشريح للثقافات شريحة
   منزوع الأيونات ومعقمة لإضافة H ₂ O :
   

   	ل 500 مل	ل 1000 مل	التركيز النهائي
   CaCl 2 (1 م)	0.5 مل	1 مل	1 ملم
   D - غلوكوز	0،901 ز	1،802 ز	10 ملي
   بوكل	0،149 ز	0،298 ز	4 ملم
   MgCl 2 (1 م)	2.5 مل	5 مل	5 ملم
   NaHCO 3	1،092 ز	2،184 ز	26 مم
   السكروز	40 غ	80 غ	234 ملي
   محلول الفينول الأحمر 0.5 ٪ في DPBS	0.5 مل	1 مل	0.1 ٪ V / V

   
   مزيج ~ 30 دقيقة
   Sterilإيزي قبل المرور عبر فلتر 0.22μm
   جعل aliquots 50 مل وتخزينها في 4 درجات مئوية لا تزيد على 2 أشهر.
2. شريحة متوسطة الثقافة (SCM)
   

   	ل 500 مل	ل 1000 مل	التركيز النهائي
   MEM النسر المتوسطة	4.2 غرام	8.4 غرام	8.4 غرام / لتر
   حصان المصل الحرارة المعطل	100 مل	200 مل	20 ٪
   L - الجلوتامين (200 ملم)	2.5 مل	5 مل	1 ملم
   CaCl 2 (1 م)	0.5 مل	1 مل	1 ملم
   MgSO 4 (1 م)	1 مل	2 مل	2 ملم
   الانسولين (1 ملغ / مل) ، الذائب في حمض الهيدروكلوريك 0.01 N	0.5 مل	1 مل	1 ملغم / لتر
   حمض الاسكوربيك ، والحل (25 ٪ W / V)	0.024 مل	0.048 مل	0.00125 ٪
   D - غلوكوز	1.16g	2.32g	13 ملم
   NaHCO 3	0.22g	0.44g	5.2 ملي
   Hepes	3.58g	7.16g	30 ملم

   
   مزيج حتى حل شامل وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة.
   ضبط الرقم الهيدروجيني ل7،27-7،28 مع هيدروكسيد الصوديوم N 1
   قياس الأسمولية. ضبط إلى 320 ملمول / كغ مع منزوع الأيونات ومعقمة O. ₂ H ويتوقع أن تضيف ما يقرب من 25-40 مل. الأسمولية الاختيار مرة أخرى.
   *** الحموضة قد تتغير قليلا حين تعديل الأسمولية ، وهذا على ما يرام ، فإنه من المهم أن الأسمولية في النطاق الصحيح (317-323).
   تعقيم قبل المرور عبر فلتر 0.22 ميكرون.
   جعل aliquots 20 مل وتخزينها لمدة تصل إلى 2-3 أسابيع في 4 درجات مئوية.
   Gluatamine المخزون : إعداد عند تركيز 200 ملم ومخزن في -20 درجة مئوية في aliquots من 2.5 مل.
   حمض الاسكوربيك الأسهم : إعداد بتركيز 25 ٪ (W / V) وتخزينها في -20 درجة مئوية في aliquots من 100 ميكرولتر.

5. ممثل النتائج :

وينبغي أن ننظر شرائح بيضاء تحت نطاق تشريح دون بقع سوداء واضحة المعالم وغير التالفة CA1 ، CA3 ، والمناطق التلفيف المسنن. ويعتبر التلوث الجرثومي وبسهولة نقل بقع سوداء في المتوسط ​​أو تعكر المجلس الأعلى للقضاء. عند وضعها تحت المجهر ، يجب على سطح شريحة تبدو نظيفة بعد 4 أيام في الثقافة مع الهيئات واضحة وdiscernibly الخلية. إذا لم يكن هناك أجسام الخلايا واضحة وينظر الكثير من الحطام ويغطي السطح بعد 4 ايام ، ومن ثم لا شريحة صحية.

Discussion

ويستند هذا الأسلوب على طريقة وصف لأول مرة من قبل Stoppini آخرون ⁽¹¹⁾ وتقدم على نحو سريع لشرائح ثقافة الحصين. الجانب الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو الحفاظ على شرائح معقمة ، وبالتالي من الأهمية بمكان استخدام تقنيات مناسبة ومعقمة بشكل صحيح لتطهير وتعقيم جميع ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture inserts	EMD Millipore	PICM03050
6 well plates	BD Biosciences	353046
Tissue Slicer	Stoelting Co.	51425/51415
Microscope	Olympus Corporation	SZX7-ILLD2-100
Hippocampus dissecting tool	F.S.T.	10099-15
Large utility scissors. Perfection	F.S.T.	37500-00/37000-00 Right/ Left handed
Iris Spatula	F.S.T.	10093-13
Straight spatula	F.S.T.	10094-13
Rounded spoon micro spatula	VWR international	57949-039
Dissecting single cutting edge needle	Electron Microscopy Sciences	72946
Dissecting tweezers	Dumont	#2
Small dissecting scissors	F.S.T.	14060-10
MEM Eagle medium	Cellgro	50-019 PB
Horse serum heat inactivated	Invitrogen	26050-88
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081
CaCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4 (1 M)	Sigma-Aldrich	M2773
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N	Sigma-Aldrich	I0516
Ascorbic Acid, solution (25%)	Sigma-Aldrich	A4544
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Hepes	Sigma-Aldrich	H7523
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS	Sigma-Aldrich	P0290
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
MgCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	M9272