A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
אנו מתארים שיטה להכין פרוסות בהיפוקמפוס organotypic כי ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים במוח. פרוסות המוח מוטלות על ממברנות נקבוביים התקשורת בתרבות מותר להקים ממשק. שיטה זו משמרת את הארכיטקטורה ברוטו של ההיפוקמפוס עד 2 שבועות בתרבות.
ההיפוקמפוס, רכיב של המערכת הלימבית, משחק תפקידים חשובים בזיכרון לטווח ארוך וניווט מרחבי 1. נוירונים בהיפוקמפוס יכול לשנות את עוצמת הקשרים שלהם לאחר תקופות קצרות של הפעלה חזקה. תופעה זו, הידועה בשם potentiation לטווח ארוך (LTP) יכולה להימשך שעות או ימים הפך את המנגנון המועמד הטוב ביותר למידה וזיכרון 2. בנוסף, אנטומיה מוגדר היטב וקישוריות של ההיפוקמפוס 3 הפכה אותה מערכת מודל קלאסי ללמוד הילוכים הסינפטי ו 4 הפלסטיות הסינפטית.
כפי הבנתנו את הפיזיולוגיה של סינפסות בהיפוקמפוס גדל שחקנים מולקולריים הפך מזוהה, צורך לתמרן חלבונים סינפטיים הכרח. תרבויות בהיפוקמפוס Organotypic להציע את האפשרות למניפולציות הגן קל התערבות פרמקולוגית מדויק אבל לשמור על ארגון הסינפטי הוא קריטי להבנת תפקוד הסינפסה בהקשר נטורליסטי יותר בתרבות שיטות שגרתיות נוירונים ניתק.
כאן אנו מציגים שיטה להכין ותרבות פרוסות בהיפוקמפוס, כי ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים במוח. שיטה זו מאפשרת גישה קלה את פרוסות עבור מניפולציה גנטית באמצעות גישות שונות כמו זיהום ויראלי או 5,6 biolistics 7. בנוסף, פרוסות ניתן לשחזר בקלות עבור מבחני ביוכימיים 8, או להעביר מיקרוסקופים הדמיה 9 או בניסויים אלקטרו 10.
1. לפני תחילת הכנת פרוסות בהיפוקמפוס.
2. הכנת פרוסות בהיפוקמפוס.
3. תרבות Slices בהיפוקמפוס
4. פתרונות
עבור 500 מ"ל | עבור מ"ל 1000 | הריכוז הסופי | |
CaCl 2 (1 ז) | 0.5 מ"ל | 1 מ"ל | 1 mM |
D-גלוקוז | 0.901 גרם | 1.802 גרם | 10 mM |
KCl | 0.149 גרם | 0.298 גרם | 4 מ"מ |
MgCl 2 (1 ז) | 2.5 מ"ל | 5 מ"ל | 5 מ"מ |
NaHCO 3 | 1.092 גרם | 2.184 גרם | 26 מ"מ |
סוכרוז | 40 גרם | 80 גרם | 234 mM |
הפתרון האדום פנול 0.5% ב DPBS | 0.5 מ"ל | 1 מ"ל | 0.1% v / v |
עבור 500 מ"ל | עבור מ"ל 1000 | הריכוז הסופי | |
ממ הנשר בינוני | 4.2 גרם | 8.4 גרם | 8.4 g / l |
סוס חום בסרום מומת | 100 מ"ל | 200 מ"ל | 20% |
L-גלוטמין (200 מ"מ) | 2.5 מ"ל | 5 מ"ל | 1 mM |
CaCl 2 (1 ז) | 0.5 מ"ל | 1 מ"ל | 1 mM |
MgSO 4 (1 מ ') | 1 מ"ל | 2 מ"ל | 2 מ"מ |
אינסולין (1 מ"ג / מ"ל), מומס HCl 0.01 N | 0.5 מ"ל | 1 מ"ל | 1 מ"ג / ליטר |
חומצה אסקורבית, פתרון (25% w / v) | .024 מ"ל | .048 מ"ל | 0.00125% |
D-גלוקוז | 1.16g | 2.32g | 13 מ"מ |
NaHCO 3 | 0.22g | 0.44g | 5.2 mM |
Hepes | 3.58g | 7.16g | 30 מ"מ |
5. נציג תוצאות:
Slices צריך להיראות לבן תחת בהיקף לנתח בלי כתמים שחורים ומוגדרים היטב CA1 ניזוק, CA3, ואזורים gyrus משוננת. זיהום חיידקי נתפסת בקלות כמו כתמים שחורים נעים בטווח הבינוני או עכירות של SCM. כאשר הניח מתחת למיקרוסקופ, את פני השטח של הפרוסה צריך להיראות נקי אחרי 4 ימים בתרבות עם גופי התא ברורה ניכר בו. אם לא ברור גופי התא נראים ופסולת הרבה המכסה את פני השטח לאחר 4 ימים, אז לא פרוסה בריא.
שיטה זו מבוססת על השיטה שתוארה לראשונה על ידי Stoppini et al. 11 ומציע בצורה מהירה פרוסות תרבות בהיפוקמפוס. ההיבט החשוב ביותר של פרוטוקול זה היא לשמור על פרוסות סטרילי ולכן זה קריטי להשתמש בטכניקות סטרילי המתאים כראוי לחיטוי לעקר את כל החומר במגע עם רקמות.
עבודה זו מומנה על ידי NINDS - NIH R01NS060756
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | ||
6 well plates | BD Falcon | 353046 | ||
Tissue Slicer | Stoelting | 51425/51415 | ||
Microscope | Olympus | SZX7-ILLD2-100 | ||
Hippocampus dissecting tool | F.S.T | 10099-15 | ||
Large utility scissors. Perfection | F.S.T | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | ||
Iris Spatula | F.S.T | 10093-13 | ||
Straight spatula | F.S.T | 10094-13 | ||
Rounded spoon micro spatula | VWR | 57949-039 | ||
Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Science | 72946 | ||
Dissecting tweezers | Dummont | #2 | ||
Small dissecting scissors | F.S.T | 14060-10 | ||
MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | ||
Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | ||
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | ||
CaCl2 (1 M) | Sigma | C3881 | ||
MgSO4 (1 M) | Sigma | M2773 | ||
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma | I0516 | ||
Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma | A4544 | ||
D-Glucose | Sigma | G5767 | ||
NaHCO3 | Sigma | S6014 | ||
Hepes | Sigma | H7523 | ||
Sucrose | Sigma | S5016 | ||
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma | P0290 | ||
KCl | Sigma | P3911 | ||
MgCl2 (1 M) | Sigma | M9272 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved