器官型海马切片培养

摘要

我们描述了一种方法来准备器官可以很容易地适应大脑的其他区域的海马。大脑切片放在多孔膜和文化传媒是可以形成一个接口。这种方法保留了长达2周文化的海马毛架构。

摘要

海马，边缘系统的一个组成部分，起着重要的作用，在长期记忆^和空间导航1。海马神经元后，可以修改其连接的实力较强的激活短暂。这种现象，长时程增强（LTP），可以持续数小时或数天，并已成为学习^和记忆2的最佳人选机制。此外，定义良好的解剖和^海马 3的连接已成为一个经典的模型系统研究突触传递和^突触可塑性的4。

由于我们了解海马突触生理学增长和分子球员成为确定，需要操纵突触蛋白成为当务之急。海马器官型文化提供易于基因操作和精确的药物干预的可能性，但仍维持突触的组织，是了解一个更自然的背景下，比常规培养方法分离​​神经元突触功能的关键。

在这里，我们提出了一个方法，准备和文化，可以很容易地适应大脑的其他区域的海马。这种方法可以方便地访问基因操纵的片，用不同的方法，如病毒^感染的5,6 ^或 biolistics 7。此外，片可以很容易地恢复为⁸生化分析，或转移到显微镜成像⁹或¹⁰电生理实验。

研究方案

1。开始之前的海马脑片的制备。

1. 准备放置一块聚四氟乙烯板，并安装一个新的刀片组织切片机。
2. 用70％乙醇擦拭组织培养（TC），引擎盖和设置解剖显微镜内。消毒的油烟机，显微镜，组织切片机和紫外线灯15分钟所有解剖工具。
3. 准备6家训练班板。每孔加750μL，切片文化传媒（SCM）的每口井和地点细胞培养插入。确保彻底湿膜与无气泡下方。板块放置在孵化器在35 ° C与5％的CO ₂毒气，直到需要。
4. 100 mL烧杯中倒入50毫升低的Na ⁺学联（解剖解决方案），并放置在冰盐水混合。泡沫低的Na ⁺学联与5％的CO ₂ / O _2的 95％，直到颜色变化和学联形式浆混合的冷冻和液体的解决方案（10-20分钟） 。
5. 获取一个P5 - P7的大鼠小狗。最多可以使用三个幼仔。

2。海马脑片制备。

1. 剪切锋利的实用工具剪刀头的动物。切开皮肤，暴露颅骨。打开，从一侧到另一侧，沿双耳线切割，然后用小剪刀沿矢状缝的头骨。可从一侧到另一侧的前一个可选的削减，以方便取出骨骼和大脑暴露。大脑迅速舀出一个圆形的微勺锅铲，并放置在解剖解决方案寒意〜1分钟浆。到60毫米的菜倒入〜10毫升的冰冷的解剖解决方案的脑转移，从烧杯中的菜。应包括大脑解剖解决方案。
2. 在解剖显微镜:将脑解剖钳压到60毫米培养皿的底部，并保持在中线。使用海马解剖工具，单独留出脑半球。海马是暴露在每个半球。然后轻轻舀海马与海马解剖工具。用解剖针完全隔离的海马和尽可能干净。
3. 剪断提示使用了P1000的过滤器枪头，轻轻吸海马和转移聚四氟乙烯薄片的组织切片机上。其凹侧海马的位置。
4. 海马垂直对齐刀片获得冠状切片，沥干液体过剩。
5. 切片海马每400微米。
6. 倒入60毫米的菜和转让使用另一个剪断P1000的过滤嘴和冷SCM切片从切片海马〜10毫升冷供应链管理。避免气泡。
7. 随着虹膜锅铲的帮助和直铲轻轻彼此分开的切片。
8. 从损坏的片分开的明确界定，并完好的片。

3。海马脑片文化

1. 与SCM和细胞培养孵化器插入带来的六孔板。另一剪断P1000的过滤嘴的帮助，转移到细胞膜中的个别切片。将每4-5片膜。要小心，不要将切片插入墙上或接近对方。必要时，使用虹膜锅铲单独的片。删除多余的介质。一旦他们对膜触摸片尽可能少。
2. 移动板背面，以孵化器和文化，在35 ° C和5％的_CO 2 。
3. 训练班罩内的变化与巴斯德吸管吸的SCM单片机每48小时。加入750μL新鲜预热SCM每口井。确保无气泡膜下形成的。

4。解决方案

1. 低Na ^+的学联-解剖切片文化的解决方案
   去离子和无菌H _{2 O}添加:
   

   	对于500毫升	对于1000毫升	终浓度
   氯化钙 （1米）	0.5毫升	1毫升	1毫米
   D -葡萄糖	0.901摹	1.802克	10毫米
   氯化钾	0.149摹	0.298摹	4毫米
   MgCl 2的 （1米）	2.5毫升	5毫升	5毫米
   碳酸氢钠3	1.092摹	2.184摹	26毫米
   蔗糖	40克	80克	234 mM的
   酚红溶液0.5％，在DPBS	0.5毫升	1毫升	0.1％V / V

   
   混合〜30分钟
   灭菌通过IZE通过0.22μm的过滤器
   在4 ° C不超过2个月50毫升分装和存储。
2. 切片培养液（SCM）
   

   	对于500毫升	对于1000毫升	终浓度
   纪念鹰培养基	4.2摹	8.4摹	8.4克/升
   马血清热灭活	100毫升	200毫升	20％
   L -谷氨酰胺（200毫米）	2.5毫升	5毫升	1毫米
   氯化钙 （1米）	0.5毫升	1毫升	1毫米
   硫酸镁 （1米）	1毫升	2毫升	2毫米
   胰岛素（1毫克/毫升），溶解在盐酸0.01 N	0.5毫升	1毫升	1毫克/升
   抗坏血酸溶液（25％W / V）	0.024毫升	0.048毫升	0.00125％
   D -葡萄糖	1.16克	2.32克	13毫米
   碳酸氢钠3	0.22克	0.44克	5.2毫米
   HEPES	3.58克	7.16克	30毫米

   
   混合，直至彻底溶解并带至室温。
   1 N氢氧化钠调节pH至7.27-7.28
   测量渗透压。调整到320毫摩尔/公斤，与去离子和消毒H ₂ O预计增加约25-40毫升。再次检查渗透压。
   *** pH值可能会略有变化而调整渗透压，这是确定的，更重要的是，在正确的范围内（317-323）的渗透压。
   通过0.22微米的过滤器通过消毒。
   20毫升分装和存储长达两三个星期在4 ° C。
   Gluatamine股票:准备200毫米和储存的浓度在2.5毫升分装在-20 ° C。
   抗坏血酸股票:准备在浓度为25％（W / V）和100μL分装保存在-20 ° C。

5。代表性的成果:

片应根据解剖范围看白无黑点，并明确界定，并完好的CA1，CA3，齿状回区域。细菌污染是很容易被视为在中期或浊度的SCM移动的小黑点。当置于显微镜下，片表面应干净，清晰和discernibly细胞机构照顾4天中文化。如果没有明确的胞体看到和许多碎片覆盖表面后4天，那么是不是一个健康的切片。

讨论

上最初Stoppini 等描述的方法，这种方法是^基于 11和海马文化提供了一个快速的方式。此协议的最重要的是保持切片无菌;因此，关键是使用适当的无菌技术，并妥善消毒和消毒与组织接触的所有材料。

血清来源的不同可以影响切片质量。我们建议先测试几个批次。如果污染是一个经常出现的问题，检查孵化器和组织文化引擎盖污染的可能来源。正确使用?...

材料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture inserts		Millipore	PICM03050
6 well plates		BD Falcon	353046
Tissue Slicer		Stoelting	51425/51415
Microscope		Olympus	SZX7-ILLD2-100
Hippocampus dissecting tool		F.S.T	10099-15
Large utility scissors. Perfection		F.S.T	37500-00/37000-00 Right/ Left handed
Iris Spatula		F.S.T	10093-13
Straight spatula		F.S.T	10094-13
Rounded spoon micro spatula		VWR	57949-039
Dissecting single cutting edge needle		Electron Microscopy Science	72946
Dissecting tweezers		Dummont	#2
Small dissecting scissors		F.S.T	14060-10
MEM Eagle medium		Cellgro	50-019 PB
Horse serum heat inactivated		Invitrogen	26050-88
L-Glutamine (200 mM)		Invitrogen	25030081
CaCl2 (1 M)		Sigma	C3881
MgSO4 (1 M)		Sigma	M2773
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N		Sigma	I0516
Ascorbic Acid, solution (25%)		Sigma	A4544
D-Glucose		Sigma	G5767
NaHCO3		Sigma	S6014
Hepes		Sigma	H7523
Sucrose		Sigma	S5016
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS		Sigma	P0290
KCl		Sigma	P3911
MgCl2 (1 M)		Sigma	M9272