Органотипической гиппокампа культур фрагмент

Резюме

Мы опишем способ получения органотипической срезах гиппокампа, которые могут быть легко адаптированы для других областей мозга. Мозг ломтики укладываются на пористые мембраны и культура СМИ позволили сформировать интерфейс. Этот метод сохраняет валового архитектуры гиппокампа на срок до 2-х недель в культуре.

Аннотация

Гиппокампе, компонент лимбической системы, играет важную роль в долговременной памяти и пространственной навигации ^1. Нейронов гиппокампа может изменять силу своих связей после коротких периодов сильной активации. Это явление, известное как долгосрочные потенцирования (LTP) может длиться в течение нескольких часов или дней и стал лучшим кандидатом механизм обучения и памяти ^2. Кроме того, четко определены анатомии и связи гиппокампа ³ сделал классической модельной системой для изучения синаптической передачи и синаптической пластичности ^4.

Как наше понимание физиологии гиппокампа синапсов вырос и молекулярных игроков стал отождествляться, должны манипулировать синаптические белки стало императивом. Органотипической гиппокампа культур дают возможность для облегчения работы генов и точное фармакологического вмешательства, но сохранить синаптических организация, которая имеет решающее значение для понимания синапсов функционировать в более натуралистическом контексте, чем обычный культуре диссоциированных методы нейронов.

Здесь мы представляем метод для подготовки и культуры срезах гиппокампа, которые могут быть легко адаптированы для других областей мозга. Этот метод позволяет легко добраться до срезы для генетических манипуляций, используя различные подходы, такие как вирусная инфекция или ^5,6 biolistics ^7. Кроме того, ломтики может быть легко восстановлено для биохимических анализов ^8, или переведены на микроскопы для работы с изображениями ⁹ или электрофизиологических экспериментов ^10.

протокол

1. Перед началом Подготовка срезах гиппокампа.

1. Подготовка ткани слайсер, размещая часть листа тефлона и монтаж нового лезвия.
2. Протрите культуре ткани (ТС) капюшон с 70% этанола и установить рассекает микроскопом внутри. Стерилизовать капот, микроскоп, ткани резки и все рассекающих инструментов в течение 15 минут с УФ-светом.
3. Подготовка шесть хорошо пластин ТК. Добавить 750 мкл часть питательных сред (SCM) в каждую лунку и место вставки культуре клеток в каждой лунке. Убедитесь, что мембраны тщательно мокрые, без пузырьков внутри. Место пластин в инкубаторе при температуре 35 ° C газом с 5% CO _2, пока это необходимо.
4. Налейте 50 мл низкой Na ⁺ ACSF (рассечение раствора) в 100 мл стакан и положите его на льду-солевой смесью. Bubble низкой Na ⁺ ACSF с 5% CO ₂ / 95% O ₂ до изменения цвета и формы ACSF суспензии смесь замороженных и жидкого раствора (10-20 мин).
5. Получить P5-P7 крысят. До трех щенков могут быть использованы.

2. Гиппокампа Подготовка Slices.

1. Вырезать голова животного с острыми ножницами полезности. Разрежьте кожу и выставить череп. Откройте череп, сокращая из стороны в сторону вдоль interaural линии, а затем вдоль стреловидного шва с небольшими ножницами. Дополнительно вырезать из стороны в сторону в передней можно сделать для облегчения удаления костей и экспозиции головного мозга. Совок из мозга быстро с округлыми ложку микро шпателем и поместить его в суспензию рассекает решение для охлаждения в течение ~ 1 минуты. Налейте ~ 10 мл ледяной рассекает раствор на 60 мм блюдо и передачи мозг от стакана к блюду. Мозг должен быть покрыт рассекает решение.
2. Под микроскопом рассекает: Место мозг и держать его на средней линии с рассекает щипцы прижат к нижней части 60 мм блюдо. Используйте гиппокампе рассекает инструмент для разделения полушарий выходя из среднего мозга. Гиппокампе которые затем выставляются на каждом полушарии. Затем осторожно совок гиппокамп с гиппокампе рассекает инструмент. Используйте рассекает иглу, чтобы полностью изолировать гиппокампе и почистите его как можно больше.
3. Использование отрезал кончик P1000 кончика пипетки фильтр, мягко аспирата гиппокампе и перенести его на лист тефлоновой ткани на срез. Позиция гиппокампа на вогнутой стороне.
4. Совместите перпендикулярно гиппокампе, чтобы лезвие, чтобы получить корональные разделы и слейте избыток жидкости.
5. Нарежьте гиппокампе через каждые 400 мкм.
6. Налейте ~ 10 мл холодного SCM в 60 мм блюдо и передачи нарезанный гиппокампе от резки с использованием другого отрезал P1000 Фильтр наконечника и холодного SCM. Избегайте пузырей.
7. С помощью шпателя радужной оболочкой и прямой шпатель мягко отдельных ломтиков друг от друга.
8. Отдельные четко определены и неповрежденной ломтики с поврежденных ломтиками.

3. Гиппокампа культуры Ломтики

1. Принесите шесть-луночных планшетах с СКМ и вставляет культуре клеток из инкубатора. С помощью другого отрезал P1000 Фильтр наконечника, передача отдельных ломтиков на мембране. Место 4-5 ломтика в мембране. Будьте осторожны, чтобы не место ломтики либо близко к стене или вставить близко друг к другу. При необходимости использовать диафрагму лопаточку, чтобы отдельные кусочки. Удалите излишки среды. Сенсорный ломтиками как можно меньше, когда они находятся на мембране.
2. Перемещение пластины обратно в инкубатор и культуры при 35 ° С и 5% СО _2.
3. Изменение СКМ каждые 48 часов внутри капота ТС на аспирационных СКМ с пипетки Пастера. Добавить 750 мкл свежего подогретого СКМ на лунку. Убедитесь в отсутствии пузырьков образуются под мембраной.

4. Решения

1. Низкий Na ⁺ ACSF - Пройдя Решение для срез культуры
   Для деионизированной и стерильные H ₂ O добавить:
   

   	На 500 мл	За 1000 мл	Конечная концентрация
   CaCl 2 (1 М)	0,5 мл	1 мл	1 мМ
   D-глюкозы	0,901 г	1,802 г	10 мМ
   KCl	0,149 г	0,298 г	4 мМ
   MgCl 2 (1 М)	2,5 мл	5 мл	5 мМ
   NaHCO 3	1,092 г	2,184 г	26 мм
   Сахароза	40 г	80 г	234 мм
   Фенол красный раствор 0,5% в DPBS	0,5 мл	1 мл	0,1% об. /

   
   Смешайте ~ 30 мин
   SterilИзе пропусканием через 0.22μm фильтр
   Сделайте 50 мл аликвоты и хранить при 4 ° С не более 2 месяцев.
2. Фрагмент культуральной среде (SCM)
   

   	На 500 мл	За 1000 мл	Конечная концентрация
   MEM Eagle среда	4,2 г	8,4 г	8,4 г / л
   Лошадиной сыворотки тепла инактивированной	100 мл	200 мл	20%
   L-глютамин (200 мм)	2,5 мл	5 мл	1 мМ
   CaCl 2 (1 М)	0,5 мл	1 мл	1 мМ
   MgSO 4 (1 М)	1 мл	2 мл	2 мМ
   Инсулин (1 мг / мл), растворенный в 0,01 н HCl	0,5 мл	1 мл	1 мг / л
   Аскорбиновая кислота, раствор (25% вес / объем)	0,024 мл	0,048 мл	0,00125%
   D-глюкозы	1.16g	2.32g	13 мм
   NaHCO 3	0.22g	0.44g	5,2 мм
   Hepes	3.58g	7.16g	30 мМ

   
   Смешайте пока полностью не растворяется и довести до комнатной температуры.
   Отрегулируйте рН до 7.27-7.28 с 1 N NaOH
   Мера осмолярности. Отрегулируйте до 320 ммоль / кг деионизированной и стерилизовать H ₂ O. Ожидать, чтобы добавить примерно 25-40 мл. Проверьте осмолярность снова.
   *** РН может немного измениться во время настройки осмолярность, это нормально, это более важно, что осмолярность находится в правильном диапазоне (317-323).
   Стерилизовать прохождения через фильтр 0,22 мкм.
   Сделайте 20 мл аликвоты и хранить в течение двух-трех недель при температуре 4 ° C.
   Gluatamine складе: подготовить в концентрации 200 мМ и хранить при температуре -20 ° С в аликвоты 2,5 мл.
   Акции Аскорбиновая кислота: подготовить в концентрации 25% (м / о) и хранили при -20 ° С в аликвоты 100 мкл.

5. Представитель Результаты:

Ломтики должны выглядеть белой под рассекает сферу без черных пятен и четко определены и неповрежденной CA1, СА3 и зубчатой ​​извилине регионах. Бактериальное загрязнение легко видеть, как движущиеся черные точки в средне-и мутность СКМ. При помещении под микроскопом, поверхность среза должна выглядеть чистым после 4 дней в культуре с четкими и ощутимо органами клетки. Если нет четкого органов ячейки видел и много мусора покрывает поверхность после 4 дней, то это не здоровое срез.

Обсуждение

Этот метод основан на методе, впервые описанный Stoppini и соавт. ¹¹ и предлагает быстрый способ к культуре срезах гиппокампа. Наиболее важным аспектом этого протокола заключается в поддержании ломтиками стерильной, поэтому очень важно использовать соответствующие методы и сте?...

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture inserts		Millipore	PICM03050
6 well plates		BD Falcon	353046
Tissue Slicer		Stoelting	51425/51415
Microscope		Olympus	SZX7-ILLD2-100
Hippocampus dissecting tool		F.S.T	10099-15
Large utility scissors. Perfection		F.S.T	37500-00/37000-00 Right/ Left handed
Iris Spatula		F.S.T	10093-13
Straight spatula		F.S.T	10094-13
Rounded spoon micro spatula		VWR	57949-039
Dissecting single cutting edge needle		Electron Microscopy Science	72946
Dissecting tweezers		Dummont	#2
Small dissecting scissors		F.S.T	14060-10
MEM Eagle medium		Cellgro	50-019 PB
Horse serum heat inactivated		Invitrogen	26050-88
L-Glutamine (200 mM)		Invitrogen	25030081
CaCl2 (1 M)		Sigma	C3881
MgSO4 (1 M)		Sigma	M2773
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N		Sigma	I0516
Ascorbic Acid, solution (25%)		Sigma	A4544
D-Glucose		Sigma	G5767
NaHCO3		Sigma	S6014
Hepes		Sigma	H7523
Sucrose		Sigma	S5016
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS		Sigma	P0290
KCl		Sigma	P3911
MgCl2 (1 M)		Sigma	M9272