Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

Özet

Biz diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir Organotipik hipokampal dilim hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Beyin dilimlerini bir arayüz oluşturmak için izin gözenekli membranlar ve kültür ortamı üzerine koydu. Bu yöntem, kültür 2 hafta kadar hipokampus brüt mimarisi korur.

Özet

Hipokampus, limbik sistemin bir bileşeni, uzun süreli hafıza ve mekansal navigasyon ¹ önemli roller oynar. Hipokampal nöron bağlantıları güçlü aktivasyon kısa bir süre sonra gücünü değiştirebilirsiniz. Uzun vadeli potansiyasyonu (LTP) olarak bilinen bu fenomen, saatler veya günler sürebilir ve öğrenme ve hafıza ² için en iyi aday mekanizması haline gelmiştir. Buna ek olarak, ³ hipokampus iyi tanımlanmış anatomi ve bağlantı sinaptik iletim ve sinaptik plastisite ⁴ çalışmada klasik bir model sistem yaptı.

Hipokampal sinaps fizyolojisi anlayışımız büyüdü ve moleküler oyuncular tespit oldu, sinaptik proteinlerin işlemek için zorunlu bir ihtiyaç haline geldi. Organotipik hipokampal kültürler kolay gen manipülasyon ve hassas farmakolojik müdahale imkanı sunan ancak sinaptik organizasyon korumak, rutin kültür ayrışmış nöronlar yöntemleri daha natüralist bağlamında sinaps fonksiyonu anlamak için kritik.

Burada diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir hipokampal dilim hazırlamak ve kültür bir yöntem mevcut. Bu yöntem viral enfeksiyon ^5,6 veya biolistics ⁷ gibi farklı yaklaşımlar kullanarak genetik manipülasyon dilimleri için kolay erişim sağlar. Buna ek olarak, dilim kolayca biyokimyasal testleri ⁸ için geri olabilir, ya da görüntüleme ⁹ veya elektrofizyolojik deneylerde ¹⁰ mikroskoplar aktarılır.

Protokol

1. Hipokampal Dilimleri Hazırlama Başlamadan Önce.

1. Teflon levha bir parça yerleştirerek yeni bir bıçak montaj doku dilimleme makinesi hazırlayın.
2. % 70 etanol ile silin ve doku kültürü (TC) kaput diseksiyon mikroskobu içine yerleştirilmiş. Davlumbaz, mikroskop, doku dilimleme makinesi ve UV ışığı ile 15 dakika boyunca tüm diseksiyon aletleri sterilize edin.
3. Altı iyi TC tabak hazırlayın. Her bir kuyunun 750 mcL dilim kültür ortamı (SCM), başına iyi yer ve hücre kültürü ekler ekleyin. Membranlar altında kabarcıklar ile iyice ıslak emin olun. 35 kuvöz tabak yerleştirin ° C kadar gerekli% 5 CO ₂ ile gaz verilerek.
4. 100 ml beher içine 50 ml düşük Na ⁺ ACSF (çözüm diseksiyon) dökün ve buz-tuz karışımı yerleştirin. Kabarcık düşük Na ⁺ ACSF% 5 CO ₂ /% 95 O ₂ ile renk değişimleri ve ACSF, dondurulmuş ve sıvı solüsyonu (10-20 dakika) bir bulamaç karışımı oluşturana kadar .
5. P5-P7 sıçan yavru alın. Kadar üç yavrular kullanılabilir.

2. Hipokampal Dilimleri hazırlanması.

1. Hayvan başkanı, keskin bir yardımcı program makas ile kesin. Cildi kesin ve kafatası maruz. Sonra küçük makas ile sagital sütür boyunca interaural hat boyunca yan yana gelen kesme ve kafatası açın. Kemik ve beyin maruz kaldırarak kolaylaştırmak için ön yan yana isteğe bağlı kesim yapılabilir. Yuvarlak bir kaşık mikro spatula ile hızlı bir şekilde beyin kepçe ve yaklaşık 1 dakika süreyle soğuk çözüm diseksiyon bulamaç yerleştirin. 60 mm bir tabağa buz soğuk diseksiyon çözüm ~ 10 ml dökün ve beher çanak beyin transferi. Beyin çözüm diseksiyon ile kaplanmış olmalıdır.
2. Altında mikroskop diseksiyon: Yer beyin ve 60 mm çanak alt basıldığında diseksiyon forseps ile orta hat tutun. Ortabeyin bırakarak hemisferlerin ayrı hipokampus kesme aleti kullanın. Hippocampi sonra her yarımkürede maruz kalmaktadır. Sonra yavaşça aracı diseksiyon hipokampus hipokampus kepçe. Hipokampus tamamen izole etmek ve mümkün olduğunca temiz diseksiyon iğnesi kullanın.
3. Snipped P1000 filtre pipet ucu hafifçe hipokampus aspirat ve doku dilimleme makinesi teflon levha aktarmak. Konkav hipokampus yerleştirin.
4. Koronal bölümleri almak ve aşırı sıvı drenaj hippocampi dik bıçak hizalayın.
5. Hippocampi her 400 mikron dilimleyin.
6. ~ 10 ml soğuk SCM, dilimleme makinesi, başka bir snipped P1000 filtre ucu ve soğuk SCM kullanarak hippocampi dilimlenmiş bir 60 mm bulaşık ve transfer içine dökün. Kabarcıklar yapmak kaçının.
7. Iris spatula ve düz bir spatula yardımıyla hafifçe birbirinden dilim ayırın.
8. Iyi tanımlanmış ve hasarsız hasarlı dilim dilim ayırın.

3. Hipokampal Dilimleri Kültür

1. Inkübatör SCM ve hücre kültürü ekler ile altı kuyucuğu getirin. Başka bir snipped P1000 filtre ucu yardımı ile tek tek dilimler, membran üzerine aktarın. Membran başına 4-5 dilimleri yerleştirin. Dilimleri eklemek duvar ya yakın ya da birbirlerine yakın yerleştirmek için dikkatli olun. Gerektiğinde ayrı dilim iris spatula kullanın. Aşırı orta çıkarın. Membran bir dilim mümkün olduğunca az dokunun.
2. Geri inkübatör plaka ve kültür 35 ° C ve% 5 CO ₂ taşıyın.
3. SCM Pasteur pipeti ile aspire TC kaput içinde SCM her 48 saat değiştirin. Taze önceden ısıtılmış SCM de ortalama 750 mcL ekleyin. Membranın altında kabarcıklar oluşur emin olun.

4. Çözümler

1. Düşük Na ⁺ ACSF - dilim kültürlere Diseksiyon Çözüm
   Deiyonize ve steril H ₂ O eklemek için:
   

   	500 ml için	1000 ml için	Final Konsantrasyon
   CaCl 2 (1 M)	0,5 mL	1 ml	1 mM
   D-glikoz	0,901 g	1,802 g	10 mM
   KCl	0,149 g	0,298 g	4 mM
   MgCl 2 (1 M)	2.5 mL	5 ml	5 mM
   NaHCO 3	1.092 g	2.184 g	26 mm
   Sakaroz	40 g	80 g	234 mm
   DPBS Fenol Kırmızı Çözüm% 0.5	0,5 mL	1 ml	% 0.1 v / v

   
   Mix ~ 30 dk.
   Steril0.22μm filtre geçişi tarafından ize
   4 ° C artık 2 aydan az 50 ml alikotları ve mağaza olun.
2. Dilim Kültür Orta (SCM)
   

   	500 ml için	1000 ml için	Final Konsantrasyon
   MEM Eagle orta	4.2 g	8.4 g	8.4 g / l
   At serum ısı inaktive	100 mL	200 mL	% 20
   L-Glutamin (200 mM)	2.5 mL	5 ml	1 mM
   CaCl 2 (1 M)	0,5 mL	1 ml	1 mM
   MgSO 4 (1 M)	1 ml	2 mL	2 mM
   İnsülin (1 mg / ml), 0.01 N HCl içinde çözünmüş	0,5 mL	1 ml	1 mg / l
   Askorbik Asit, çözüm (% 25 w / v)	0.024 ml	0.048 ml	0,00125%
   D-glikoz	1.16g	2.32g	13 mm
   NaHCO 3	0.22g	0.44g	5.2 mM
   HEPES	3.58g	7.16g	30 mm

   
   Iyice eriyene kadar karıştırın ve oda sıcaklığına getirmek.
   1 N NaOH ile pH 7,27-7,28 için ayarlayın.
   Ölçü ozmolarite. Deiyonize ve sterilize H ₂ O. ile 320 mmol / kg ayarlayın Yaklaşık 25-40 ml eklemek için bekliyoruz. Ozmolarite yeniden kontrol edin.
   Ozmolarite ayarlayarak, *** pH biraz değişebilir, bu tamam, ozmolarite doğru aralığı (317-323) olduğunu daha önemlidir.
   0.22 mikron filtre geçişi ile sterilize edin.
   20 ml alikotları ve mağaza olun az iki-üç hafta kadar 4 ° C
   Gluatamine stok: -20 ° C'de 2.5 mL hacimde 200 mM ve mağaza bir konsantrasyon hazırlamak.
   Askorbik asit stoğu:% 25 (w / v) 'lik bir konsantrasyon hazırlamak ve 100 mcL hacimde -20 ° C'de saklanır.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Dilimler diseksiyon kapsamında beyaz, siyah noktalar olmadan bakmak ve iyi tanımlanmış ve hasarsız CA1, CA3 ve dentat girus bölgelerinin. Bakteriyel kontaminasyon kolayca SCM orta veya bulanıklık hareket eden siyah lekeler olarak görülür. Mikroskop altında konulduğunda, dilim yüzey açık ve ayırt edilir hücre organları ile 4 gün sonra kültür temiz görünmelidir. Net hücre gövdeleri görülür ve çok enkaz 4 gün sonra yüzeyini kaplayan, daha sonra sağlıklı bir dilim değildir.

Tartışmalar

Bu yöntem ¹¹ ilk Stoppini ve ark tarafından tanımlanan yöntem ve kültür hipokampal dilimleri hızlı bir şekilde sunuyor. Bu protokolün en önemli yönü dilim steril korumak için, bu nedenle uygun steril teknikler kullanmak ve düzgün doku ile temas eden tüm malzeme dezenfekte ve sterilize etmek için kritik öneme sahiptir.

Farklı serumlar kaynakları dilimleri kalitesini etkileyebilir. Biz ilk birkaç toplu test tavsiye ederiz. Kontaminasyon tekrarlayan bir...

Malzemeler

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture inserts		Millipore	PICM03050
6 well plates		BD Falcon	353046
Tissue Slicer		Stoelting	51425/51415
Microscope		Olympus	SZX7-ILLD2-100
Hippocampus dissecting tool		F.S.T	10099-15
Large utility scissors. Perfection		F.S.T	37500-00/37000-00 Right/ Left handed
Iris Spatula		F.S.T	10093-13
Straight spatula		F.S.T	10094-13
Rounded spoon micro spatula		VWR	57949-039
Dissecting single cutting edge needle		Electron Microscopy Science	72946
Dissecting tweezers		Dummont	#2
Small dissecting scissors		F.S.T	14060-10
MEM Eagle medium		Cellgro	50-019 PB
Horse serum heat inactivated		Invitrogen	26050-88
L-Glutamine (200 mM)		Invitrogen	25030081
CaCl2 (1 M)		Sigma	C3881
MgSO4 (1 M)		Sigma	M2773
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N		Sigma	I0516
Ascorbic Acid, solution (25%)		Sigma	A4544
D-Glucose		Sigma	G5767
NaHCO3		Sigma	S6014
Hepes		Sigma	H7523
Sucrose		Sigma	S5016
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS		Sigma	P0290
KCl		Sigma	P3911
MgCl2 (1 M)		Sigma	M9272