器官型海馬切片培養

要約

我々は簡単に他の脳領域に適合させることができる器官型海馬切片を調製する方法を説明します。脳スライスは、インタフェースを形成するために許可されている多孔質膜と培地上に置かれている。このメソッドは、最大の文化の2週間までの海馬の総アーキテクチャを保持します。

要約

海馬、大脳辺縁系の構成要素は、長期記憶と空間ナビゲーション¹の重要な役割を果たしている。海馬ニューロンは、強力な活性化の短い期間の後にその接続の強さを変更することができます。長期増強（LTP）と呼ばれるこの現象は、数時間または数日間続く ​​ことができますし、学習と記憶²の最良の候補メカニズムとなっています。さらに、海馬³のよく定義された解剖学との接続は、そのシナプス伝達とシナプス可塑性の^4を研究する古典的なモデルシステムてきた。

海馬シナプスの生理学の理解が成長し、分子の選手は、識別されたになるにつれ、シナプスタンパク質を操作する必要性が不可欠となった。器官型海馬培養が容易な遺伝子操作と正確な薬理学的介入の可能性を提供しますが、日常的な文化解離ニューロンの方法よりも自然な文脈におけるシナプス機能を理解する上で重要であるシナプスの組織を維持する。

ここでは簡単に他の脳領域に適合させることができる海馬スライスを準備し、文化に方法を提示する。このメソッドは、ウイルス感染^5,6またはbiolistics ^7のようなさまざまなアプローチを用いて遺伝子操作のためのスライスに簡単にアクセスできます。さらに、スライスを簡単に生化学的ア ​​ッセイ⁸用に回収できる、またはイメージング⁹または電気生理学的実験¹⁰の顕微鏡に転送する。

プロトコル

1。海馬スライスの準備を開始する前に。

1. テフロンシートの部分を置き、新​​しいブレードを取り付けることで、組織スライサーを準備します。
2. 70％エタノールで組織培養（TC）フードを拭き、解剖顕微鏡の内部に設定してください。フード、顕微鏡、組織スライサーおよびUV光で15分間すべての解剖器具を滅菌する。
3. シックスウェルTCプレートを準備します。各ウェルに750μLのスライス培養培地（SCM）ウェルあたりと場所​​細胞培養インサートを追加。膜が下にない泡で十分に濡れていることを確認してください。 35℃インキュベーターでプレートを置きます°必要になるまで、5％CO ₂でガス処刑。
4. 100mLのビーカーに50mLの低Na ^+の ACSFを（解決策を解剖）注ぎ、氷塩ミックスの上に置きます。色の変化とACSFが凍結し、液体溶液（10〜20分）のスラリーの混合を形成するまで5％CO ₂ / 95％O ₂とバブル低Na ^+の ACSF。
5. P5 - P7のラットは、子犬得る。最大3つの仔を使用することができます。

2。海馬スライスの準備。

1. シャープのユーティリティはさみで動物の頭をカット。皮膚をカットし、頭蓋骨を公開。両耳間のラインに沿って、その後、小さなはさみで矢状縫合に沿って左右にカットして頭蓋骨を開きます。フロントの左右にオプションのカットは、骨と脳の露出を除去する容易にするために行うことができます。丸いスプーンミクロスパチュラで迅速に脳をかき出すと、約1分間冷却する為のソリューションを解剖のスラリーに入れてください。 〜60mmの皿に氷冷解剖溶液10 mLを入れ、ビーカーから皿に脳を転送する。脳は、解剖ソリューションでカバーされるべきである。
2. 解剖顕微鏡の下：脳を置き、60mmの皿の底に押さ解剖ピンセットで正中線でそれを保持する。中脳を残して半球を分けるために海馬解剖ツールを使用してください。海馬は、それぞれの半球で公開されています。その後そっとツールを解剖海馬と海馬をかき出す。完全に海馬を分離し、可能な限りそれをきれいに解剖針を使用してください。
3. P1000フィルターピペットチップのsnipped先端を使用して、ゆっくりと海馬を吸引除去し、組織のスライサーにテフロンシートに転送します。その凹面側の海馬を置きます。
4. 冠状のセクションを取得し、液体の過剰を排出するためにブレードに海馬の垂直位置を合わせます。
5. 海馬は、400μmのスライス。
6. 別のsnipped P1000フィルターチップとコールドSCMを使用してスライサーから海馬をスライスした60mmディッシュと転送に約10 mLの冷SCMを注ぐ。泡を作ることは避けてください。
7. アイリスのヘラとストレートヘラの助けを借りてそっとお互いのスライスを切り離す。
8. 明確に定義し、破損していないスライスは、破損したスライスから区切ります。

3。海馬スライスの文化

1. インキュベーターからSCMや細胞培養インサートで6 - ウェルプレートを持参。別のsnipped P1000フィルターチップの助けを借りて、メンブレンに個々のスライスを転送する。膜4〜5のスライスを置きます。スライスのいずれかのインサート壁に近づけたり、互いに近くに配置しないように注意してください。必要な場合には、別のスライスにアイリスのヘラを使用してください。余分な培地を取り外します。彼らは細胞膜上に存在したら、できるだけ少ないとしてスライスをタッチ。
2. 35でバックインキュベーターにプレートと文化を移動℃、5％CO _2。
3. パスツールピペットでSCMを吸引することによってTCのフード内SCM、48時間毎に変更する。ウェル当たりの新鮮予め温めておいたSCMを750μLを加える。は気泡が膜の下に形成されていないことを確認してください。

4。ソリューション

1. ローのNa ⁺ ACSF -スライス培養のための解剖ソリューション
   イオンと滅菌H ₂ Oを追加するには：
   

   	500mLのための	1000mLのための	最終濃度
   のCaCl 2（1 M）	0.5mLの	1 mLの	1mMの
   D -グルコース	0.901グラム	1.802グラム	10 mMの
   塩化カリウム	0.149グラム	0.298グラム	4mMの
   MgCl 2の （1 M）	2.5mLの	5 mLの	5mMの
   NaHCO 3の	1.092グラム	2.184グラム	26mmの
   スクロース	40グラム	80グラム	234 mMの
   DPBSでフェノールレッド溶液0.5パーセント	0.5mLの	1 mLの	0.1パーセントV / V

   
   ミックス〜30分
   滅菌0.22μmフィルターを通過させることによってIZE
   2ヶ月以上を50mL分注し、4℃で保存されなくてください。
2. スライス培養培地（SCM）
   

   	500mLのための	1000mLのための	最終濃度
   MEMイーグル培地	4.2グラム	8.4グラム	8.4グラム/リットル
   不活化ウマ血清熱	100mLの	200 mLの	20パーセント
   L -グルタミン（200mMの）	2.5mLの	5 mLの	1mMの
   のCaCl 2（1 M）	0.5mLの	1 mLの	1mMの
   MgSO 4を （1 M）	1 mLの	2 mLの	2mMの
   塩酸0.01 Nに溶解インスリン（1 mg / mL）は、	0.5mLの	1 mLの	1mg / lの
   アスコルビン酸、溶液（25％w / v）の	0.024 mLの	0.048 mLの	0.00125%
   D -グルコース	1.16グラム	2.32グラム	13 mmの
   NaHCO 3の	0.22グラム	0.44グラム	5.2 mMの
   HEPES	3.58グラム	7.16グラム	30mMの

   
   完全に溶解するまで混合し、室温にもたらす。
   1 N NaOHで7.27から7.28にpHを調整する
   浸透圧を測定します。脱イオン滅菌H _{2 O}で320ミリモル/ kgに調整する約25〜40 mLを追加する予定。再び浸透圧を確認してください。
   浸透圧を調整しながら*** pHが若干変更される可能性がある、これはOKです、それは浸透圧が正しい範囲（317〜323）になっていることより重要です。
   0.22μmフィルターを通過させることによって滅菌する。
   4で二から三週間までに20 mLのアリコートとストアを行います℃に
   Gluatamineの株式：2.5 mLのアリコートで-20℃で200mmと店舗の濃度で準備する。
   アスコルビン酸の株式：25％の濃度（w / v）で準備し、100μLのアリコートで-20℃で保存されている。

5。代表的な結果：

スライスは黒い斑点なし解剖範囲で白く見えるとよく定義されており、無傷のCA1、CA3、および歯状回領域があります。細菌汚染を簡単にSCMの培地や濁度に黒の斑点を移動すると見られている。顕微鏡下に置かれたとき、スライスの表面には、はっきりと目に見えて細胞体と培養中の4日後にきれいになるはずです。明確な細胞体は見られないと多くの破片が4日後に表面を覆っている場合は、健全なスライスではありません。

ディスカッション

このメソッドは、 最初のStoppini らの方法に基づいて¹¹および文化海馬スライスへの迅速な方法を提供しています。このプロトコルの最も重要な側面は、スライスが無菌維持することであるため、それは適切な無菌テクニックを使用するために、適切に組織と接触するすべての素材を消毒殺菌することが重要です。

異なる血清源は、スライスの品質に...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture inserts	EMD Millipore	PICM03050
6 well plates	BD Biosciences	353046
Tissue Slicer	Stoelting Co.	51425/51415
Microscope	Olympus Corporation	SZX7-ILLD2-100
Hippocampus dissecting tool	F.S.T.	10099-15
Large utility scissors. Perfection	F.S.T.	37500-00/37000-00 Right/ Left handed
Iris Spatula	F.S.T.	10093-13
Straight spatula	F.S.T.	10094-13
Rounded spoon micro spatula	VWR international	57949-039
Dissecting single cutting edge needle	Electron Microscopy Sciences	72946
Dissecting tweezers	Dumont	#2
Small dissecting scissors	F.S.T.	14060-10
MEM Eagle medium	Cellgro	50-019 PB
Horse serum heat inactivated	Invitrogen	26050-88
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081
CaCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4 (1 M)	Sigma-Aldrich	M2773
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N	Sigma-Aldrich	I0516
Ascorbic Acid, solution (25%)	Sigma-Aldrich	A4544
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Hepes	Sigma-Aldrich	H7523
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS	Sigma-Aldrich	P0290
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
MgCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	M9272