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Method Article
我々は簡単に他の脳領域に適合させることができる器官型海馬切片を調製する方法を説明します。脳スライスは、インタフェースを形成するために許可されている多孔質膜と培地上に置かれている。このメソッドは、最大の文化の2週間までの海馬の総アーキテクチャを保持します。
海馬、大脳辺縁系の構成要素は、長期記憶と空間ナビゲーション1の重要な役割を果たしている。海馬ニューロンは、強力な活性化の短い期間の後にその接続の強さを変更することができます。長期増強(LTP)と呼ばれるこの現象は、数時間または数日間続く ことができますし、学習と記憶2の最良の候補メカニズムとなっています。さらに、海馬3のよく定義された解剖学との接続は、そのシナプス伝達とシナプス可塑性の4を研究する古典的なモデルシステムてきた。
海馬シナプスの生理学の理解が成長し、分子の選手は、識別されたになるにつれ、シナプスタンパク質を操作する必要性が不可欠となった。器官型海馬培養が容易な遺伝子操作と正確な薬理学的介入の可能性を提供しますが、日常的な文化解離ニューロンの方法よりも自然な文脈におけるシナプス機能を理解する上で重要であるシナプスの組織を維持する。
ここでは簡単に他の脳領域に適合させることができる海馬スライスを準備し、文化に方法を提示する。このメソッドは、ウイルス感染5,6またはbiolistics 7のようなさまざまなアプローチを用いて遺伝子操作のためのスライスに簡単にアクセスできます。さらに、スライスを簡単に生化学的ア ッセイ8用に回収できる、またはイメージング9または電気生理学的実験10の顕微鏡に転送する。
1。海馬スライスの準備を開始する前に。
2。海馬スライスの準備。
3。海馬スライスの文化
4。ソリューション
500mLのための | 1000mLのための | 最終濃度 | |
のCaCl 2(1 M) | 0.5mLの | 1 mLの | 1mMの |
D -グルコース | 0.901グラム | 1.802グラム | 10 mMの |
塩化カリウム | 0.149グラム | 0.298グラム | 4mMの |
MgCl 2の (1 M) | 2.5mLの | 5 mLの | 5mMの |
NaHCO 3の | 1.092グラム | 2.184グラム | 26mmの |
スクロース | 40グラム | 80グラム | 234 mMの |
DPBSでフェノールレッド溶液0.5パーセント | 0.5mLの | 1 mLの | 0.1パーセントV / V |
500mLのための | 1000mLのための | 最終濃度 | |
MEMイーグル培地 | 4.2グラム | 8.4グラム | 8.4グラム/リットル |
不活化ウマ血清熱 | 100mLの | 200 mLの | 20パーセント |
L -グルタミン(200mMの) | 2.5mLの | 5 mLの | 1mMの |
のCaCl 2(1 M) | 0.5mLの | 1 mLの | 1mMの |
MgSO 4を (1 M) | 1 mLの | 2 mLの | 2mMの |
塩酸0.01 Nに溶解インスリン(1 mg / mL)は、 | 0.5mLの | 1 mLの | 1mg / lの |
アスコルビン酸、溶液(25%w / v)の | 0.024 mLの | 0.048 mLの | 0.00125% |
D -グルコース | 1.16グラム | 2.32グラム | 13 mmの |
NaHCO 3の | 0.22グラム | 0.44グラム | 5.2 mMの |
HEPES | 3.58グラム | 7.16グラム | 30mMの |
5。代表的な結果:
スライスは黒い斑点なし解剖範囲で白く見えるとよく定義されており、無傷のCA1、CA3、および歯状回領域があります。細菌汚染を簡単にSCMの培地や濁度に黒の斑点を移動すると見られている。顕微鏡下に置かれたとき、スライスの表面には、はっきりと目に見えて細胞体と培養中の4日後にきれいになるはずです。明確な細胞体は見られないと多くの破片が4日後に表面を覆っている場合は、健全なスライスではありません。
このメソッドは、 最初のStoppini らの方法に基づいて11および文化海馬スライスへの迅速な方法を提供しています。このプロトコルの最も重要な側面は、スライスが無菌維持することであるため、それは適切な無菌テクニックを使用するために、適切に組織と接触するすべての素材を消毒殺菌することが重要です。
異なる血清源は、スライスの品質に...
この作品は、NINDSによって賄われていた - NIH R01NS060756を
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | ||
6 well plates | BD Falcon | 353046 | ||
Tissue Slicer | Stoelting | 51425/51415 | ||
Microscope | Olympus | SZX7-ILLD2-100 | ||
Hippocampus dissecting tool | F.S.T | 10099-15 | ||
Large utility scissors. Perfection | F.S.T | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | ||
Iris Spatula | F.S.T | 10093-13 | ||
Straight spatula | F.S.T | 10094-13 | ||
Rounded spoon micro spatula | VWR | 57949-039 | ||
Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Science | 72946 | ||
Dissecting tweezers | Dummont | #2 | ||
Small dissecting scissors | F.S.T | 14060-10 | ||
MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | ||
Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | ||
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | ||
CaCl2 (1 M) | Sigma | C3881 | ||
MgSO4 (1 M) | Sigma | M2773 | ||
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma | I0516 | ||
Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma | A4544 | ||
D-Glucose | Sigma | G5767 | ||
NaHCO3 | Sigma | S6014 | ||
Hepes | Sigma | H7523 | ||
Sucrose | Sigma | S5016 | ||
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma | P0290 | ||
KCl | Sigma | P3911 | ||
MgCl2 (1 M) | Sigma | M9272 |
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