Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

Resumo

Nós descrevemos um método para preparar organotípicas fatias do hipocampo que pode ser facilmente adaptado a outras regiões do cérebro. Fatias de cérebro são colocadas em membranas porosas e meios de cultura está autorizado a formar uma interface. Este método preserva a arquitetura bruta do hipocampo para até duas semanas em cultura.

Resumo

O hipocampo, um componente do sistema límbico, desempenha um papel importante na memória de longo prazo e navegação espacial ^1. Neurônios do hipocampo pode modificar a força de suas conexões, após breves períodos de forte ativação. Esse fenômeno, conhecido como potenciação de longa duração (LTP) pode durar horas ou dias e tornou-se o mecanismo melhor candidato para o aprendizado ea memória ^2. Além disso, a anatomia bem definidos e conectividade do hipocampo ³ tornou um sistema modelo clássico para estudar a transmissão sináptica e ⁴ plasticidade sináptica.

Como nossa compreensão da fisiologia das sinapses do hipocampo cresceu e jogadores molecular tornou-se identificado, a necessidade de manipular proteínas sinápticas tornou-se imperativo. Organotípicas culturas hipocampais oferecer a possibilidade de manipulação genética fácil e intervenção farmacológica, mas precisa manter a organização sináptica que é fundamental para a compreensão da função sinapse em um contexto mais naturalista do que rotina métodos cultura dissociada neurônios.

Aqui apresentamos um método para preparar e cultura fatias do hipocampo que pode ser facilmente adaptado a outras regiões do cérebro. Este método permite fácil acesso às fatias para a manipulação genética usando abordagens diferentes, como infecção viral ou ^5,6 Biolistics ^7. Além disso, as fatias podem ser facilmente recuperados para ensaios bioquímicos ^8, ou transferidos para microscópios para imagens de ⁹ ou ¹⁰ experimentos eletrofisiológicos.

Protocolo

1. Antes de iniciar a preparação de fatias do hipocampo.

1. Prepare o slicer tecido, colocando um pedaço de folha de teflon e montagem de uma nova lâmina.
2. Limpe a cultura de tecidos capô (TC) com etanol 70% e definir o interior microscópio de dissecação. Esterilizar o capô, microscópio, slicer tecido e todos os instrumentos de dissecação por 15 minutos com a luz UV.
3. Preparar seis pratos bem TC. Adicionar 750 mL da cultura de mídia fatia (SCM) por bem e colocar insere cultura de células em cada poço. Certifique-se que as membranas são completamente molhado com nenhuma bolha por baixo. Coloque as placas em estufa a 35 ° C gaseados com 5% de CO ₂ até necessário.
4. Despeje 50 mL baixo Na ⁺ ACSF (dissecando solução) em um copo de 100 ml e coloque-o no gelo sal-mix. A bolha baixo Na ⁺ ACSF com 5% de CO ₂ / 95% O ₂ até que muda de cor e formas ACSF uma mistura de chorume de solução congelada e líquidos (10-20 min).
5. Obter um rato P5-P7 filhote. Até três filhotes podem ser usados.

2. Preparação fatias do hipocampo.

1. Cortar a cabeça do animal com uma tesoura afiada utilitário. Cortar a pele e expor o crânio. Abrir o crânio, cortando de lado a lado ao longo da linha interaural e depois ao longo da sutura sagital com uma tesoura pequena. Um corte opcional de lado a lado na frente pode ser feito para facilitar a remoção dos ossos e da exposição do cérebro. Retire o cérebro rapidamente com uma espátula colher arredondada micro e colocá-lo na pasta de dissecar solução para refrigerar para ~ 1 minuto. Despeje ~ 10 mL de solução gelada de dissecação em um prato de 60 mm e transferir o cérebro do copo ao prato. O cérebro deve ser coberto com dissecação solução.
2. Sob o microscópio de dissecação: Coloque o cérebro e mantê-lo na linha média com a pinça de dissecação pressionado para o fundo do prato de 60 mm. Use a ferramenta de hipocampo de dissecação para separar os hemisférios deixando de fora o mesencéfalo. O hipocampo são expostos em cada hemisfério. Então suavemente colher o hipocampo com o hipocampo dissecar ferramenta. Use a agulha de dissecação para isolar completamente o hipocampo e limpá-lo, tanto quanto possível.
3. Usando uma ponta de um snipped P1000 ponteira de filtro, aspirar cuidadosamente o hipocampo e transferi-lo para a folha de Teflon na slicer tecido. Posição do hipocampo em seu lado côncavo.
4. Alinhar o hipocampo perpendicular à lâmina para obtenção de cortes coronal e drenar o excesso de líquido.
5. Corte o hipocampo cada mM 400.
6. Despeje ~ 10 mL frio SCM em um prato de 60 mm e de transferência de fatias do hipocampo slicer usando outro snipped P1000 ponta de filtro e frio SCM. Evite fazer bolhas.
7. Com a ajuda de uma espátula de íris e uma espátula reta separar delicadamente as fatias do outro.
8. Separe fatias bem definidos e sem danos de fatias danificado.

3. Cultura fatias do hipocampo

1. Trazer as placas de seis bem com SCM e inserções de cultura de células da incubadora. Com a ajuda de uma outra ponta P1000 snipped filtro, transferência de fatias individuais para a membrana. Coloque fatias de 4-5 por membrana. Tenha cuidado para não colocar as fatias ou perto da parede inserir ou próximos uns dos outros. Quando necessário, use uma espátula de íris em fatias separadas. Remova o meio de excesso. Toque fatias tão pouco quanto possível uma vez que estão na membrana.
2. Mova placa de volta para incubadora e cultura a 35 ° CO C e 5% _2.
3. Alterar SCM cada 48 horas no interior do capô TC por aspiração do SCM com uma pipeta Pasteur. Adicionar 750 mL de produtos frescos pré-aquecido SCM por poço. Verifique se não há bolhas são formadas sob a membrana.

4. Soluções

1. Baixa Na ⁺ ACSF - Solução Dissecting para culturas fatia
   Para deionizada e estéril H ₂ O add:
   

   	Para 500 mL	Para 1000 mL	Concentração Final
   CaCl 2 (1 M)	0,5 mL	1 mL	1 mM
   D-Glicose	0,901 g	1,802 g	10 mM
   KCl	0,149 g	0,298 g	4 mM
   MgCl 2 (1 M)	2,5 mL	5 mL	5 mM
   NaHCO 3	1,092 g	2,184 g	26 mM
   Sacarose	40 g	80 g	234 mM
   Solução Vermelho de fenol 0,5% em DPBS	0,5 mL	1 mL	0,1% v / v

   
   Mix ~ 30 min
   Sterilize pela passagem através de filtro de 0.22μm
   Fazer 50 mL alíquotas e armazenar a 4 ° C no máximo dois meses.
2. Médio fatia Cultura (SCM)
   

   	Para 500 mL	Para 1000 mL	Concentração Final
   MEM de Eagle médio	4,2 g	8,4 g	8,4 g / l
   Cavalo de calor soro inativado	100 mL	200 mL	20%
   L-Glutamina (200 mM)	2,5 mL	5 mL	1 mM
   CaCl 2 (1 M)	0,5 mL	1 mL	1 mM
   MgSO 4 (1 M)	1 mL	2 mL	2 mM
   Insulina (1 mg / mL), dissolvido em HCl 0,01 N	0,5 mL	1 mL	1 mg / l
   Ácido ascórbico, solução (25% w / v)	0,024 mL	0,048 mL	0,00125%
   D-Glicose	1,16 g	2.32g	13 mM
   NaHCO 3	0.22g	0.44g	5,2 mM
   Hepes	3.58g	7.16g	30 mM

   
   Misture até ficar bem dissolvido e trazer à temperatura ambiente.
   Ajustar o pH a 7,27-7,28 com NaOH 1 N
   Osmolaridade medida. Ajuste a 320 mmol / kg com deionizada e esterilizados H ₂ O. Espera adicionar aproximadamente 25-40 mL. Verifique osmolaridade novamente.
   *** PH pode mudar um pouco durante o ajuste da osmolaridade, isso é ok, é mais importante que a osmolaridade está na faixa correta (317-323).
   Esterilizar em passagem pelo filtro de 0,22 mM.
   Faça 20 mL alíquotas e armazenar por até 2-3 semanas a 4 ° C.
   Gluatamine estoque: prepare a uma concentração de 200 mM e armazenar a -20 ° C em alíquotas de 2,5 mL.
   Estoque de ácido ascórbico: prepare a uma concentração de 25% (w / v) e armazenadas a -20 ° C em alíquotas de 100 mL.

5. Resultados representativos:

Fatias deve olhar branco sob um escopo dissecar sem manchas negras e bem definidas e sem danos CA1, CA3, e regiões do giro denteado. Contaminação bacteriana é facilmente visto como movendo pintas pretas no meio ou turvação da SCM. Quando colocado sob o microscópio, a superfície da fatia deve olhar limpo após 4 dias em cultura, com corpos celulares claro e perceptivelmente. Se nenhum corpo de células claras são vistas e detritos muito cobre a superfície após 4 dias, então não é uma fatia saudável.

Discussão

Este método é baseado no método descrito pela primeira vez por Stoppini et al. ¹¹ e oferece uma forma rápida de fatias do hipocampo cultura. O aspecto mais importante deste protocolo é para manter fatias de estéril e por isso é fundamental para o uso adequado de técnicas estéreis e adequadamente desinfectar e esterilizar todo o material em contato com o tecido.

Fontes diferentes soros podem influenciar a qualidade das fatias. É aconselhável testar vários lotes...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture inserts	EMD Millipore	PICM03050
6 well plates	BD Biosciences	353046
Tissue Slicer	Stoelting Co.	51425/51415
Microscope	Olympus Corporation	SZX7-ILLD2-100
Hippocampus dissecting tool	F.S.T.	10099-15
Large utility scissors. Perfection	F.S.T.	37500-00/37000-00 Right/ Left handed
Iris Spatula	F.S.T.	10093-13
Straight spatula	F.S.T.	10094-13
Rounded spoon micro spatula	VWR international	57949-039
Dissecting single cutting edge needle	Electron Microscopy Sciences	72946
Dissecting tweezers	Dumont	#2
Small dissecting scissors	F.S.T.	14060-10
MEM Eagle medium	Cellgro	50-019 PB
Horse serum heat inactivated	Invitrogen	26050-88
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081
CaCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4 (1 M)	Sigma-Aldrich	M2773
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N	Sigma-Aldrich	I0516
Ascorbic Acid, solution (25%)	Sigma-Aldrich	A4544
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Hepes	Sigma-Aldrich	H7523
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS	Sigma-Aldrich	P0290
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
MgCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	M9272