Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur organotypischen Schnitten des Hippocampus, die leicht auf andere Hirnregionen angepasst werden vorbereiten können. Hirnschnitten sind auf porösen Membranen und Kulturmedien ist erlaubt, um eine Schnittstelle bilden gelegt. Diese Methode schont die grobe Architektur des Hippocampus für bis zu 2 Wochen in Kultur.

Zusammenfassung

Der Hippocampus, einer Komponente des limbischen Systems, spielt eine wichtige Rolle in das Langzeitgedächtnis und die räumliche Navigation ^1. Hippocampus-Neuronen können die Stärke ihrer Verbindungen nach kurzen starke Aktivierung ändern. Dieses Phänomen, das als Langzeit-Potenzierung (LTP) bekannt ist, kann für Stunden oder Tage dauern und ist mittlerweile der beste Kandidat Mechanismus für Lernen und Gedächtnis ^2. Darüber hinaus hat der gut definierten Anatomie und Konnektivität des Hippocampus ³ hergestellt ist ein klassisches Modellsystem zur synaptischen Übertragung und synaptische Plastizität ^4-Studie.

Als unser Verständnis der Physiologie des Hippocampus Synapsen wuchs und molekulare Spieler identifiziert wurde, wurde die Notwendigkeit, synaptischer Proteine ​​zu manipulieren unerlässlich. Organotypischen hippokampalen Kulturen bieten die Möglichkeit für eine einfache Genmanipulation und präzise pharmakologische Intervention, sondern pflegen synaptischen Organisation, die entscheidend für das Verständnis Synapse Funktion in einem naturalistischen Kontext als Routine-Kultur dissoziierten Neuronen Methoden ist.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Vorbereitung und Kultur Schnitten des Hippocampus, die leicht auf andere Hirnregionen angepasst werden können. Diese Methode ermöglicht den einfachen Zugriff auf die Scheiben zur genetischen Manipulation mit unterschiedlichen Ansätzen, wie virale Infektionen oder ^5,6 Biolistik ^7. Darüber hinaus können Scheiben leicht für biochemische Assays ⁸ gewonnen werden, oder an Mikroskopen für die Bildgebung ⁹ oder elektrophysiologischen Experimenten ^10.

Protokoll

1. Vor dem Start der Vorbereitung von Schnitten des Hippocampus.

1. Bereiten Sie das Gewebe Allesschneider, indem ein Stück Teflon Blatt und Montage einer neuen Klinge.
2. Wischen Sie die Gewebekultur (TC) Kapuze mit 70% Ethanol und stellen Sie die Präpariermikroskop innen. Sterilisieren der Haube, Mikroskop, Gewebe Hobel und alle Sezierbesteck für 15 Minuten mit UV-Licht.
3. Bereiten Sie sechs gut TC-Platten. Add 750 ul Stück Kultur Medien (SCM) pro Vertiefung und Ort Zellkultureinsätzen in jede Vertiefung. Sicherstellen, dass die Membranen sind völlig nass ohne Blasen darunter. Legen Sie die Platten im Brutschrank bei 35 ° C mit 5% CO ₂ begast, bis sie benötigt.
4. Gießen Sie 50 mL niedrigen Na ⁺ ACSF (Sezieren Lösung) in einem 100 mL Becherglas und stellen Sie es auf dem Eis-Salz-Mischung. Blase den niedrigen Na ⁺ ACSF mit 5% CO ₂ / 95% O ₂ bis zum Farbumschlag und ACSF bildet einen Schlamm-Mix von gefrorenen und flüssigen Lösung (10-20 min).
5. Get a P5-P7 Jungtier. Bis zu drei Welpen eingesetzt werden kann.

2. Schnitten des Hippocampus Vorbereitung.

1. Schneiden Sie den Kopf des Tieres mit scharfen Schere Dienstprogramm. Schneiden Sie die Haut und setzen den Schädel. Öffnen des Schädels durch Schneiden von Seite zu Seite entlang der interauralen Linie und dann entlang der Sagittalnaht mit einer kleinen Schere. Eine optionale Schnitt von Seite zu Seite in der Front gemacht zu erleichtern das Entfernen der Knochen und der Exposition des Gehirns sein. Scoop aus dem Gehirn schnell mit einem abgerundeten Löffel Mikrospatel und legen Sie sie in die Gülle zu sezieren Lösung für ~ 1 Minute chill. Gießen Sie ca. 10 mL eiskaltem Sezieren Lösung auf eine 60 mm Schale und den Transfer des Gehirns aus dem Becher in die Schale. Das Gehirn soll mit Sezieren Lösung abgedeckt werden.
2. Unter dem Binokular: Place des Gehirns und halten Sie ihn an der Mittellinie mit der Pinzette gedrückt, um den unteren Rand des 60 mm Schale. Verwenden Sie den Hippocampus Sezieren Werkzeug, um die Halbkugeln Weglassen des Mittelhirns zu trennen. Der Hippocampus werden dann auf jeder Hemisphäre ausgesetzt. Dann vorsichtig mit einer Schaufel Hippocampus mit dem Hippocampus Sezieren Werkzeug. Verwenden Sie die Präpariernadel völlig zu isolieren Hippocampus und reinigen Sie sie so weit wie möglich.
3. Mit einem snipped Spitze eines P1000 Filter Pipettenspitze vorsichtig aspirieren Hippocampus und überträgt es auf die Teflon Folie auf das Gewebe Schneidemaschine. Position des Hippocampus auf der konkaven Seite.
4. Richten Sie die hippocampi senkrecht zur Klinge koronalen Abschnitte zu erhalten und Drain überschüssige Flüssigkeit.
5. Schneiden Sie die hippocampi alle 400 um.
6. Gießen Sie ca. 10 ml kaltem SCM in eine 60 mm Schale und den Transfer in Scheiben geschnitten hippocampi vom Allesschneider mit anderen snipped P1000 Filter Spitze und kalten SCM. Vermeiden Sie Luftblasen.
7. Mit Hilfe eines Iris-Spachtel und einer geraden Spatel vorsichtig trennen die Scheiben voneinander.
8. Separate gut definiert und unbeschädigt Scheiben von beschädigten Scheiben.

3. Schnitten des Hippocampus Kultur

1. Bringen Sie die Sechs-Well-Platten mit SCM-und Zellkultur-Einsätze aus dem Inkubator. Mit Hilfe eines anderen snipped P1000 Filter Spitze, Transfer einzelnen Scheiben auf die Membran. Legen Sie 4-5 Scheiben pro Membran. Achten Sie darauf, statt der Scheiben entweder an die Wand legen nahe oder dicht beieinander. Wenn nötig, verwenden Iris Spatel zu trennen Scheiben schneiden. Entfernen Sie überschüssiges Medium. Touch-Scheiben so wenig wie möglich, sobald sie auf der Membran sind.
2. Bewegen Platte zurück zum Inkubator und Kultur bei 35 ° C und 5% CO _2.
3. Ändern SCM alle 48 Stunden innerhalb des TC Haube durch Absaugen des SCM mit einer Pasteurpipette. Add 750 ml frisches vorgewärmtes SCM pro Vertiefung. Achten Sie darauf, keine Blasen unter der Membran gebildet werden.

4. Lösungen

1. Low Na ⁺ ACSF - Dissecting Lösung für Slice Kulturen
   Um deionisiertem und sterilem H ₂ O hinzu:
   

   	Für 500 ml	Für 1000 ml	Endkonzentration
   CaCl 2 (1 M)	0,5 ml	1 mL	1 mM
   D-Glucose	0,901 g	1,802 g	10 mM
   KCl	0,149 g	0,298 g	4 mM
   MgCl 2 (1 M)	2,5 ml	5 mL	5 mM
   NaHCO 3	1,092 g	2,184 g	26 mM
   Sucrose	40 g	80 g	234 mm
   Phenolrotlösung 0,5% in DPBS	0,5 ml	1 mL	0,1% v / v

   
   Mix ~ 30 min
   Sterilize Durchgang durch 0,22 &mgr; m-Filter
   Machen Sie 50 mL aliquotiert und bei 4 ° C nicht länger als 2 Monate.
2. Slice-Kulturmedium (SCM)
   

   	Für 500 ml	Für 1000 ml	Endkonzentration
   MEM Eagle Medium	4,2 g	8,4 g	8,4 g / l
   Pferdeserum hitzeinaktiviertem	100 mL	200 mL	20%
   L-Glutamin (200 mM)	2,5 ml	5 mL	1 mM
   CaCl 2 (1 M)	0,5 ml	1 mL	1 mM
   MgSO 4 (1 M)	1 mL	2 mL	2 mM
   Insulin (1 mg / mL), gelöst in 0,01 N HCl	0,5 ml	1 mL	1 mg / l
   Ascorbinsäure, Lösung (25% w / v)	0,024 ml	0,048 ml	0,00125%
   D-Glucose	1.16g	2.32g	13 mM
   NaHCO 3	0.22g	0,44 g	5,2 mm
   Hepes	3.58g	7.16g	30 mM

   
   Mix bis gänzlich aufgelöst und auf Raumtemperatur bringen.
   Der pH-Wert auf 7,27 bis 7,28 mit 1 N NaOH
   Messen Osmolarität. Passen Sie auf 320 mmol / kg mit deionisiertem und sterilisiert H ₂ O. Erwarten Sie etwa 25-40 ml hinzuzufügen. Überprüfen Sie Osmolarität wieder.
   *** PH-Wert kann etwas ändern beim Einstellen der Osmolarität, das in Ordnung ist, ist es umso wichtiger, dass die Osmolarität im richtigen Bereich (317-323) ist.
   Sterilisieren durch Passage durch 0,22 um-Filter.
   Machen Sie 20 mL Aliquots und speichern bis zu 2-3 Wochen bei 4 ° C.
   Gluatamine Lager: Vorbereitung in einer Konzentration von 200 mM und bei -20 ° C in Aliquots von 2,5 mL.
   Ascorbinsäure Lager: Vorbereitung in einer Konzentration von 25% (w / v) und bei -20 ° C in Aliquots von 100 ul.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Scheiben aussehen sollte unter einem Binokular weiß ohne schwarze Flecken und gut definiert und unbeschädigt CA1, CA3 und Gyrus dentatus Regionen. Bakterielle Kontamination ist leicht wie das Verschieben schwarze Flecken in der mittleren oder Trübung des SCM zu sehen. Wenn unter dem Mikroskop gelegt, sollte die Oberfläche der Scheibe schauen nach 4 Tagen in Kultur sauber mit klaren und nachvollziehbaren Zellkörper. Wenn keine klare Zellkörper zu sehen sind und viel Schutt bedeckt die Oberfläche nach 4 Tagen, dann ist keine gesunde Scheibe.

Diskussion

Diese Methode basiert auf der Methode zuerst von Stoppini et al beschrieben ist. ¹¹ und bietet eine schnelle Art und Weise zur Kultur Schnitten des Hippocampus. Der wichtigste Aspekt dieses Protokolls ist die Erhaltung Scheiben steril, daher ist es wichtig, geeignete sterile Techniken zu verwenden und richtig zu desinfizieren und sterilisieren das gesamte Material in Kontakt mit dem Gewebe.

Verschiedene Seren Quellen können Einfluss auf die Qualität der Scheibe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture inserts	EMD Millipore	PICM03050
6 well plates	BD Biosciences	353046
Tissue Slicer	Stoelting Co.	51425/51415
Microscope	Olympus Corporation	SZX7-ILLD2-100
Hippocampus dissecting tool	F.S.T.	10099-15
Large utility scissors. Perfection	F.S.T.	37500-00/37000-00 Right/ Left handed
Iris Spatula	F.S.T.	10093-13
Straight spatula	F.S.T.	10094-13
Rounded spoon micro spatula	VWR international	57949-039
Dissecting single cutting edge needle	Electron Microscopy Sciences	72946
Dissecting tweezers	Dumont	#2
Small dissecting scissors	F.S.T.	14060-10
MEM Eagle medium	Cellgro	50-019 PB
Horse serum heat inactivated	Invitrogen	26050-88
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081
CaCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4 (1 M)	Sigma-Aldrich	M2773
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N	Sigma-Aldrich	I0516
Ascorbic Acid, solution (25%)	Sigma-Aldrich	A4544
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Hepes	Sigma-Aldrich	H7523
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS	Sigma-Aldrich	P0290
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
MgCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	M9272