قياس التماسك الحصى بواسطة Tensiometry الأنسجة السطحية

Summary

نحن تصف طريقة لقياس الطاقة الملزمة ، كما expressible التوتر السطحي الأنسجة ، وبين خلايا الأنسجة داخل المجاميع مثل 3D. وقد أظهرت الاختلافات في التوتر السطحي للربط مع أنسجة الرئة الغازية ، العضلات ، وأورام الدماغ ، والمحددات الأساسية لإقامة العلاقات المكانية بين أنواع مختلفة من الخلايا.

Abstract

لا يمكن القياس الدقيق لطاقة الربط بين الخلايا يتم باستخدام أساليب ترتكز على مبادئ الديناميكا الحرارية في النظم في التوازن. وقد طورنا tensiometry الأنسجة السطحية (TST) خصيصا لقياس الطاقة السطح خالية من التفاعل بين الخلايا. لقد كانت المفاهيم الكامنة وراء تجارة الرقيق عبر الأطلسي البيوفيزيائية الموصوفة سابقا في ^1،2 التفصيل. وتستند هذه الطريقة على ملاحظة أن الخلايا متماسكة بعضها بعضا ، إذا حافظت في الهز والثقافة ، وسيكون التجمع في مجموعات تلقائيا. بمرور الوقت ، فإن هذه المجموعات الجولة تصل إلى شكل المجالات. هذا السلوك التقريب متابعة يحاكي خصائص سلوك النظم السائلة. وتقاس طاقة الربط بين الخلايا عن طريق ضغط الركام كروية بين لوحات موازية في مقياس التوتر السطحي الأنسجة السطحية مصمم خصيصا. يتم استخدام نفس المعادلة الرياضية المستخدمة لقياس التوتر السطحي لقطرة السائل لقياس التوتر السطحي للمجاميع الأنسجة مثل 3D كروية. أي ما يعادل الخلوية من التوتر السطحي السائل طاقة الربط بين الخلايا ، أو أكثر عموما cohesivity الأنسجة. وقد أظهرت دراسات سابقة من أن الأنسجة مختبرنا التوتر السطحي (1) كيف تتوقع مجموعتين من الخلايا الجنينية سوف تتفاعل مع بعضها البعض ^1-5 ، (2) يمكن أن تؤثر بشدة على قدرة للتفاعل مع الأنسجة الحيوية ⁶ ، (3) يمكن لا يمكن تغييرها إلا من خلال التلاعب المباشر للكادهيرين المستندة إلى التماسك بين الخلايا ⁷ ، ولكن أيضا عن طريق التلاعب من الجزيئات ECM رئيسية مثل FN ^11/08 و 4) يرتبط الغازية المحتملة لسرطان الرئة ¹² ، ¹³ ليفية ، ورم في الدماغ وورم البروستاتا ¹⁴ خطوط الخلية ^15. في هذه المقالة سوف نقوم وصف الجهاز ، بالتفصيل الخطوات المطلوبة لتوليد الأجسام الشبه الكروية ، لتحميل الأجسام الشبه الكروية في غرفة مقياس التوتر السطحي ، للشروع في الضغط الكلي ، وتحليلها والتحقق من صحة القياسات التوتر الأنسجة السطحية ولدت.

Protocol

1. تجميع استعدادا لقياس التوتر السطحي الأنسجة.

لخلايا ملتصقة ، يمكن تشكيل الأجسام الشبه الكروية باستخدام الأسلوب قطرة شنقا أو عن طريق توليد ورقة متماسكة من الخلايا التي يمكن بعد ذلك يقتطع أجزاء 1 مم.

الكلي من خلال طريقة تشكيل قطرة معلقة :

1. يجب أن تنمو قرب متموجة الثقافات الخلية تمسكا التقاء 90 ٪ ، يجب شطف monolayers عندها مرتين مع برنامج تلفزيوني. بعد افراغ جيدا ، إضافة 2 ملل (لوحات 100 ملم) من 0.05 ٪ التربسين EDTA - 1 ملم ، واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا. وقف trypsinization بإضافة 2 ملل من المتوسط ​​الشامل واستخدامها بلطف ماصة 5 مل لمتمزج الخليط حتى الخلايا في التعليق. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
2. إضافة 40 ميكروليتر من 10 ملغ / مل محلول المخزون الدناز واحتضان لمدة 5 دقائق على RT. دوامة لفترة وجيزة وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
3. تجاهل طاف بيليه وتغسل مع 1 مل كامل نسيج ثقافة المتوسط. أكرر ، ثم الخلايا في resuspend 2 ملل من اكتمال النسيج المتوسط ​​الثقافة.
4. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ، أو الآلي لمكافحة الخلية وضبط تركيز الخلايا إلى 2.5 × 10 ⁶ / مل.
5. إزالة الغطاء من طبق نسيج الثقافة 60 مم ومكان 5 مليليتر من برنامج تلفزيوني في قاع الطبق. هذا سوف يكون بمثابة غرفة الترطيب.
6. عكس غطاء واستخدام ماصة 20 ميكرولتر إيداع 10 قطرات ميكرولتر على الجزء السفلي من الغطاء. تأكد من أن يتم وضع قطرات بعيدا بما فيه الكفاية بحيث لا يمس. فمن الممكن لوضع ما لا يقل عن 20 نقطة في الطبق.
7. اقلب الغطاء على PBS غرفة مليئة القاع واحتضان ثاني أكسيد الكربون في 37 ° C / 5 ٪ / ₂ الرطوبة 95 ٪ ، ومراقبة قطرات اليومية واحتضان حتى أوراق الخلية أو المجاميع شكلت.
8. مرة واحدة شكل صفائح ، ويمكن تحويلها إلى شاكر الزجاج جولة القاع القوارير التي تحتوي على 3 ملل المتوسطة كاملة والمحتضنة في حمام مائي تهتز عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ حتى شكل الأجسام الشبه الكروية.

إجمالي تشكيل خلية من طريقة ورقة :

9. مستعدون تعليق خلية واحدة كما هو موضح أعلاه ولكن يتم ضبط تركيز على الخلايا 1x10 ⁶ / مل.
10. نقل 3 مل من التعليق الخلية إلى 10 قوارير جولة القاع مل (وكالة بلكو ، Vineland ، ونيو جيرسي).
11. احتضان القوارير في حمام مائي لفاف / شاكر (نيو برونزويك العلمية وأديسون ، ونيو جيرسي) عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO ₂ لل4H عند 120 دورة في الدقيقة حتى يتعافى من الخلايا trypsinization.
12. نقل الخلايا إلى أجهزة الطرد المركزي أنبوب زجاجي ذهابا والقاع ، وأجهزة الطرد المركزي في ز X 200 إلى بيليه رقيقة. احتضان لمدة 24 ساعة حتى ورقة أشكال متماسكة.
13. بلطف دوامة أنبوب لإخراج الثقافة ورقة وسكب محتويات الثقافة في أنبوب صغير ، صحن زجاجي معقم زراعة الأنسجة.
14. استخدام المشارط الدقيقة لقطع الأوراق إلى أجزاء مختلفة الأحجام.
15. احتضان شظايا عند 37 درجة مئوية على شاكر بالحمام المائي عند 120 دورة في الدقيقة تدويري يقل عن 5 ٪ CO ₂ من 2 إلى 3 أيام أو حتى تصبح كروية.

2. قياس التوتر السطحي الكلي

1. مقياس التوتر السطحي للنسيج السطح. يظهر الجهاز في التين. 1 و 2. وتتألف الخلية ضغط (الشكل 3) من مجلسين. توصيل الغرفة الخارجي (OC) إلى 37 درجة مئوية مضخة المياه المتداولة ، ويعمل على تنظيم درجة حرارة الغرفة الداخلية (IC). هي التي شيدت الغرف Delrin المضروب وتحتوي على نوافذ الكوارتز لتصور من مجموع المباراتين. ويستخدم أقل من التجمع (لوس انجليس) مسامير في قاعدة للغرفة الداخلية و1) موقف الكلي في الغرفة الداخلية ، 2) ختم الجزء السفلي من الغرفة الداخلية ، 3) رفع الكلي للشروع في ضغط و (4 ) التحكم في المسافة بين لوحات متوازية ، وبالتالي الضغط من المجموع. جوهر المركزية (سي سي) التابعة للجمعية هو قابل للتعديل. وتتألف غيض من نواة مركزية (ورمى) من تفلون سلس وبمثابة لوحة انخفاض الضغط (LCP). لوحة الضغط العلوي (UCP) هي اسطوانة تفلون 15mm الطويلة التي تتدلى من ذراع الميزان (B) من قبل اللهب تقويمها سلك النيكل والكروم (المجلس القومي للمرأة) *. أثناء التجربة ، تم وضع التجميعية الخلية (أ) على لوحة وأثار انخفاض حتى إنها تجري اتصالات مع لوحة العلوي. توصيل لوحة العلوي إلى ذراع الميزان (B). ضغط من إجمالي أسباب النزوح للذراع الميزان. التوازن هو كاهن / Ventron نموذج تسجيل electrobalance 2000 ، والتي تعمل على مبدأ التوازن فارغة. نقطة ارتكاز للذراع الميزان لديه حديد التسليح داخل مجال مغناطيسي دائم. عندما تعمل على التوازن ، فإنه ينظم باستمرار مرور التيار من خلال التجمع الكهرومغناطيسية ، والذي بدوره يحافظ على ذراع التوازن في وضع أفقي. عندما يتم تعليق كائن من ذراع الميزان ، والجهد ، والذي ينطبق على التوازن للحفاظ على ذراع في horizoموقف ntal ، يتناسب مع وزن الكائن. هذا الجهد يقيس قوة خارجية ضاغطة تطبيقها على مجموع المباراتين. ويتم رصد شكل الكلي من خلال الملاحظة البصرية من خلال المجسام × 25 SMZ10A نيكون بالإضافة إلى جهاز كمبيوتر مجهز المختطف الإطار. من أجل تقليل التصاق الركام الخلية إلى لوحات ضغط ، سواء كانت مغلفة لوحات الضغط السفلي والعلوي مع بولي (2 - hydroxyethylmethacrylate) {بولي (هيما)} ، وهي مادة البوليمر إلى الخلايا التي لا تلتزم ^16.
   * والسلك هو اللهب تقويمها شنقا بطول 15 بوصة من الأسلاك من موقف معوجة ولقط مقطع الموثق صغيرة حتى النهاية. ثم يتم تشغيل ناسخ بنسن صعودا ونزولا على طول السلك حتى يضيء السلك الأحمر. ويمكن عندئذ تقويم السلك تكون مقطعة إلى أطوال مناسبة. يتم تشكيل هوك الصغيرة عن طريق ثني السلك حوالي ربع من شبر واحد من نهاية باستخدام شفرات الحلاقة اثنين. ثم يتم إدخال الطرف الآخر في برميل من لوحة انخفاض الضغط.
2. مجموع الضغط.
   1. يملأ الغرفة الداخلية مع ما قبل حرارة CO ₂ - مستقلة نسيج الثقافة المتوسطة (Gibco / BRL ، NY).
   2. يتم وضع الركام يتراوح حجمها ما بين 200-300 μ حول على لوحة انخفاض ضغط (الشكل 4A). المجاميع التي يتم تحميلها الشفط تجمعا في وسط زراعة الأنسجة في منتصف الطريق حتى غيض من ماصة باستير مزودة مبة سيليكون ، نقل ماصة للغرفة الداخلية ، وتحديد المواقع غيض من ماصة فوق LCP. ومن ثم تجميع طرد بلطف على نظام الإجراءات الجزائية عن طريق الضغط بلطف لمبة. بدلا من ذلك ، سمح للالكلي للسقوط بفعل الجاذبية على نظام الإجراءات الجزائية.
   3. يتم وضع صفيحة ضغط العليا (UCP) فوق الركام ويسمح للتسوية ، وإنشاء ما قبل ضغط الوزن UCP الواضح الأساس.
   4. ومن ثم أثار LCP حتى يتم ضغط التجميعية ضد UCP (الشكل 4B). وضبط ارتفاع النواة الداخلية لانخفاض جهاز تحكم بدرجات مختلفة من الضغط. ويتم رصد ضغط عن طريق الملاحظة من خلال مجهر تشريح مجهزة بكاميرا فيديو CCD.
   5. يتم التقاط الصور الكلي ، رقمية ، وتحليلها باستخدام ImageJ. ويسجل باستمرار واضحة تغير الوزن UCP على شريط مسجل التخطيط ، وتحقيق التوازن الذي شكل الرمز بواسطة خارج التسوية الناتج التوازن كاهن والجهد. يخضع كل الإجمالية إلى 2 درجات مختلفة من الضغط.
3. حساب التوتر السطحي الكلي.
   التوازن في الشكل ، ويمكن الحصول على cohesivity من مجموع الخلايا مضغوطة بين لوحات الموازية التي لا تلتزم من المعادلة يونغ لابلاس (الشكل 5) ، حيث يتم σ cohesivity ، F هي القوة المؤثرة لضغط التجميعية ، πr ₃ ² هي مساحة السطح الكلي على أساسها يمارس F القوة ، وR ₂ و ₃ R هي ، على التوالي ، في دائرة نصف قطرها من خط الاستواء من المجموع مضغوطة ونصف قطرها قوس تحديد صورتها العادية السطحية للضغط لوحات وتمتد بينهما (الشكل 6). قياس قوة الضغط والهندسة في القوة والتوازن وشكل تطبيق هذه القياسات لمعادلة لابلاس يونغ يولد القيم العددية للنسيج واضح التوتر السطحي. عند بلوغ التوازن وحساب σ ₁ ، المجاميع هي ضغط ويسمح للنهج التوازن σ الثاني ويتم احتساب ₂ كما هو موضح أعلاه.
4. تأكيد من السيولة الإجمالية.
   التوتر السطحي لحساب مجموع السائل ، وعندما يتعرض لاثنين من الاختزالات مختلفة لا تزال مستمرة. في مثل هذه المجاميع نسبة σ ₂ / ₁ وسيتم σ يساوي 1 ، وسوف تكون أقل من نسبة القوة المطبقة في كل ضغط على التوالي (F ₂ / F _1). في المقابل ، فإن التوتر السطحي لحساب مجموع مرونة طاعة القانون هوك وزيادة متناسب للقوة تطبيقها. بالنسبة للمجاميع مرونة نسبة σ ₂ / ₁ σ لن تكون تساوي 1 ولكن بدلا من ذلك النهج نسبة ₁ / ₂ F F. فإن التوتر السطحي للمجاميع السائل أيضا أن تكون مستقلة عن حجم الكلي ^2،17. وتستخدم القياسات الوحيدة التي التوتر السطحي هو قوة مستقلة عن تطبيقها وحجم متوسط ​​لحساب σ لكل خط الخلية.

3. ممثل النتائج :

أدناه هو جدول النتائج TST نموذجية بالنسبة للمجاميع من الخلايا الليفية البروستاتا الفئران (الجبهة الوطنية الرواندية) والفئران خلايا العضلات الملساء البروستاتا (RPSMC). كما يمكن أن يرى في الشكل. 7 تجمعات من خلايا الجبهة الوطنية الرواندية وتوتر سطح 22.8 ± 1.1 dynes / سم. وعلاوة على ذلك ، فإن التوتر السطحي يعني القيم المقاسة بعد ضغط 1 و 2 بعد ضغط IDENT إحصائياعند مقارنة كال من خلال اختبار - T المقترنة. كما قارنا نسب σ ₂ / ₁ و F σ ₂ / F ₁ إلى التأكد من أن هذه المجاميع لم يطيعوا القانون هوك ، كما أنهم إذا كانوا يتصرفون والمواد الصلبة المرنة. كما هو موضح في الجدول رقم 1 ، نسبة σ ₂ / ₁ σ النهج لا في الواقع 1.0. علاوة على ذلك ، كانت نسبة ₁ / ₂ F F أكبر بكثير من σ ₂ / σ ₁ (إقران اختبار t ، P <0.05) ، مما يؤكد أيضا أن هذه المجاميع لا يطيعون القانون هوك وتصرفوا في الواقع كما السوائل. في المقابل RPSMCs يطاع قانون هوك. كما هو واضح في الجدول رقم 1 ، ونسبة σ ₂ / ₁ σ أكبر بكثير من (1) وكان لا تختلف إحصائيا من ذلك من ₁ / ₂ F F. لمزيد من شرح السائل مثل السلوك ، اكتشفنا العلاقة بين التوتر السطحي (σ) والحجم الكلي. كما يمكن أن يرى في الشكل. 8 ، مستقلة عن حجم سيجما للخلايا الجبهة الوطنية الرواندية (خط أحمر الانحدار ، ص ² = 0.002) ، في حين يبدو أن هناك بعض من الاعتماد على حجم سيجما للRPSMCs (الأزرق خط الانحدار ، ص ² = 0.146). هذه البيانات تؤكد أيضا أن الجبهة الوطنية الرواندية المجاميع تتصرف بطريقة تشبه السائل ، في حين ان تلك التي يبدو أنها تتصرف RPSMCs كجوامد أكثر مرونة. وسوف تستخدم فقط تلك التي تم الحصول عليها من المجاميع mesurements يتصرف والسوائل لحساب التوتر السطحي.

الشكل 1. نظرة عامة على مقياس التوتر السطحي نسيج السطح.

الشكل 2. رأي أكثر تفصيلا للغرفة مقياس التوتر السطحي (اللوحة اليمنى).

عرض تخطيطي الرقم 3. مقياس التوتر السطحي للغرفة.

الشكل 4. صور من المجاميع (B) غير مضغوط (A) ومضغوط.

الشكل 5. معادلة لابلاس.

الشكل 6. رسم توضيحي لقطرات السائل المضغوط بين صفيحتين بالتوازي مع الذي تلتزم على نحو رديء ، في توازن الشكل. R ₁ و ₂ R هي كعبرة الأساسيان للانحناء ، في خط الاستواء والحبرية في الطائرة من خلال محورها التناظر ، على التوالي. R ₃ هو نصف قطرها من مساحة دائرية الحبرية في اتصال مع لوحة ضغط سواء. H هي المسافة بين لوحات ضغط العلوي والسفلي. X هو جانب واحد من مثلث قائم الزاوية مع الوتر R ₂ تمتد إلى نقطة اتصال بين سطح القطيرات وإما لوحة الضغط.

	σ 1 (dynes / سم ± SEM)	σ 2 (dynes / سم ± SEM)	Pσ 1 ضد 2 σ	σ 1،2 (dynes / سم ± SEM)	σ 2 / 1 σ	F 2 / F 1	Pσ 2 / 1 و F σ 2 F 1
الجبهة الوطنية الرواندية	22.6 ± 1.7	22.9 ± 1.4	> 0.05 *	22.8 ± 1.1	1.04 ± 0.04	1.47 ± 0.06	<0.05
RPSMC	15.0 ± 2.8	23.0 ± 3.2	0،039	NA	1.9 ± 0.3	1.6 ± 0.1	0.16 *

الشكل 7. قياسات تجارة الرقيق عبر الأطلسي وتأكيد السيولة الإجمالية لتجمعات من الخلايا الليفية البروستاتا الفئران وخلايا العضلات الملساء.

الشكل 8 : العلاقة بين حجم سيغما وبالنسبة للمجاميع من الجبهة الوطنية الرواندية (خط أحمر) وRPSMCs (الخط الأزرق).

Discussion

قياس التماسك مجموع مباراتي الذهاب وتجارة الرقيق عبر الأطلسي واضحة نسبيا. هناك ، ومع ذلك ، والخطوات الأساسية التي يجب أن يلم من أجل توليد البيانات TST صالحة للاستعمال ؛ 1) المجاميع يجب أن تكون "سليمة". يمكن التحكم بذلك عن طريق ضمان أن يبدأ تكوين خلايا الكلية التي هي ?...

Materials