Method Article
المعروض من الجزر من النوع 2 السكري للبحوث غير كافية. هنا نحن لدينا حصة بروتوكول لعزل الجزر من المرضى الذين يخضعون لاستئصال البنكرياس جزئيا. هذا النهج يمثل فرصة فريدة للحصول على الجزر من السكري من النوع 2 وغير المتطابقة سريريا السكري الموضوعات بأعداد كافية للدراسات الأساسية والسريرية.
وقد أعاق التحقيقات في إمراض السكري من النوع 2 والجزر من خلل انجرهانز 1 من محدودية الجزر السكري نوع 2 من 2 المتبرعين بالأعضاء. هنا نحن لدينا حصة بروتوكول لعزل الجزر من نسيج البنكرياس الإنسان الحصول عليها من مرضى السكري من النوع 2 السكري وغير المرضى الذين خضعوا لاستئصال البنكرياس جزئيا بسبب أمراض مختلفة البنكرياس (أورام حميدة أو خبيثة البنكرياس ، التهاب البنكرياس المزمن ، والقناة الصفراوية المشتركة أو الأورام الاثني عشر) . أعطى جميع المرضى المشاركين موافقتهم على هذه الدراسة ، التي لديها أيضا تمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاق المحلية. على الفور تم تسليم العينات الجراحية إلى الطبيب الشرعي الذي اختار ناعمة وصحية أنسجة البنكرياس تظهر للعزلة الجزيرة ، الإبقاء على الأنسجة التالفة لأغراض التشخيص. كنا قد وجدنا أن لعزل أكثر من 1000 جزيرة ، لتبدأ على الأقل 2 غرام من نسيج البنكرياس. من الضروري أيضا أن بروتوكول جهدنا ليتمدد بشكل ملحوظ عند حقن الأنسجة وسائل الإعلام التي تحتوي على انزيم واللحم المفروم لاحقا للمساعدة على الهضم من خلال زيادة مساحة السطح.
لتوسيع نطاق تطبيق بروتوكول لتشمل حالة عرضية فيه كمية كبيرة (> 15G) من نسيج البنكرياس البشرية المتاحة ، واستخدمنا غرفة Ricordi (50 مل) لهضم الأنسجة. خلال عملية الهضم ، ونحن هزت يدويا غرفة Ricordi 3 في شدة أن تتفاوت من العينة وفقا لمستواها من تليف الأنسجة. واستخدمت بعد ذلك التدرج Ficoll discontinous لفصل الأنسجة من الجزر عنيبية. لاحظنا أن بيليه الأنسجة يجب أن تكون صغيرة بما يكفي لتكون معلق في وسط متجانس Ficoll مع كثافة 1.125 غرام / مليلتر. بعد عزلة ، ونحن المثقفين الجزر في ظل ظروف خالية من الإجهاد (لم تهتز أو التناوب) مع 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل من أجل تسهيل تعافيهم وظيفية. ويمكن تطبيق البروتوكول على نطاق واسع لدينا وتحسينها في المستقبل تمكين الحصاد في الوقت المناسب لكميات كبيرة من الجزر البشرية من مرض السكري والمتطابقة سريريا الموضوعات غير مصاب بالسكري ، والمضي قدما إلى حد كبير البحوث داء السكري من النوع 2.
1. نسيج البنكرياس جمع في غرفة العمليات
2. اختيار الأنسجة لجزيرة العزلة
3. عزلة الجزر الإنسان
4. الإنسان الدائرة البنكرياس الهضم
الشكل 1. عملية الهضم والبنكرياس الإنسان الدائرة هضم البنكرياس الإنسان الدائرة تضم غرفة تحتوي على شبكة Ricordi (قطر المسام : 600 ميكرون) ، وثلاث قطع الرخام نيتريد السيليكون (القطر : 15 ملم). والدافع تدفق من غرفة إلى الأنسجة قارورة جمع بواسطة مضخة تمعجية (140 مل / دقيقة). الأسهم تشير إلى اتجاه التدفق. المحافظة على درجة الحرارة المثلى لعملية الهضم الأنزيمي بغمر ملف التسخين في حمام ماء C ° 37.
5. الغسيل بعد الهضم
6. تنقية على التدرج Ficoll
7. جزيرة جمع والثقافة
أسفرت بروتوكول لدينا في المتوسط من الجزر 500 ~ لكل غرام من النسيج البنكرياس ، على الرغم من تفاوت كبير بين هذه الاستعدادات إلى حد كبير بسبب الاختلافات في والنشاط كولاجيناز التليف. حققنا> جزيرة نقاء 90 ٪ بحلول الأول مع تلوين Dithizone أثناء معالجة الأنسجة ، ثم انتقاء منها بعد 24 ساعة من العزلة. لتحديد نوعية الجزر منقى ، نحن اختبار لمدة 25 ملي الجلوكوز حفز افراز الانسولين في ظل ظروف ثابتة لمدة 2 ساعة. تم العثور على افراز الانسولين يمكن أن تقارن من الجزر التي تم الحصول عليها من العزلة جزيرة ECIT ومراكز الزرع. لأنه ليس المقصود من الجزر المعزولة بنكرياسات مستأصل البنكرياس جزئيا عن زرع جزيرة ، وتقييم مجموع IEQ لا يعتبر عاملا حاسما.
الأهم من ذلك ، تمكين لدينا وسيلة لنا لعزل الجزر للدراسات الفنية من المرضى 25 مستأصل البنكرياس الجزئي بين عامي 2005 و 5 عام 2008. وقد تم تحليل هذه الجزر لالجلوكوز حفز افراز الانسولين ومحددة بروتين تعبير بواسطة النشاف الغربية والمناعية. ويمكن أيضا الجزر المعزولة من بنكرياسات pancreatecomized جزئيا استخدامها للمقارنة بين الجينات والبروتينات ملامح التعبير ، والمظهر التركيبية الوظيفية والاستجابات من الجزر غير المصابين بالبول السكري ومرض السكري. لأن هناك المزيد من المرضى الذين يخضعون لاستئصال البنكرياس جزئيا من هناك المتبرعين ، ويمكن لدينا بروتوكول يسمح جمع عينات كافية والبيانات للتحليل الإحصائي قوية.
باستخدام بروتوكول لدينا ، ويمكن الإنسان من الجزر المعزولة أنسجة البنكرياس التي جمعت من استئصال البنكرياس الجزئي. نجاح هذا البروتوكول يعتمد على الرعاية التي اتخذت خلال نقطة حرجة قليلة. للحفاظ على سلامة خلايا بيتا ، فمن الضروري أن يتم نقل العينات بسرعة على الجليد إلى المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون الأمثل مدة الهضم الأنسجة تجريبيا وفقا لدرجة تليف الأنسجة والنشاط الأنزيمي من وسائل الإعلام. هذا ينطبق أيضا على درجة من القوة الميكانيكية المطبقة يدويا إلى غرفة Ricordi. وبالتالي الحصول على محصول جيد جزيرة ، يتم تنفيذ بروتوكول أفضل من قبل عالم مخصصة أو مساعد تقني. الفشل الأولي هو القاعدة ما لم يتم بالفعل فريق من ذوي الخبرة في عزلة الجزيرة.
هناك اختلافات رئيسية بين جزيرة لدينا بروتوكول العزلة والعزلة مستوى جزيرة البشرية الأسلوب : 1) على الرغم من أننا استخدام أنسجة البنكرياس تعرض لعدة ساعات من نقص التروية أثناء إجراء الجراحة ، ويتم معالجتها على الفور في الموقع. هذا هو على النقيض من بنكرياسات explanted من الدماغ ميت المانحين لالبنكرياس / جزيرة الزرع الدماغية التي تبقى لعدة ساعات خلال تخصيص وتسليمها للمنشأة جزيرة العزلة. 2) نحن كولاجيناز حقن مباشرة في أنسجة البنكرياس ، في حين أن البروتوكول هو معيار لضخه في القناة البنكرياسية. 3) ونحن منفصلة الجزر باستخدام التدرج Ficoll متقطع بدلا من جمع الجزر من الانحدار المستمر Ficoll باستخدام معالج الخلية كوبي.
في الحالات التي تكون فيها عينة جراحية نادرة جدا أو تليفي لعزل عدد كاف من الجزر ، لا يزال الأنسجة التي يمكن استرجاع microdissection التقاط الليزر (LCM) 10. هذا يسمح استرداد البيانات من عينة التعبير الجيني تقريبا ، حتى إذا فشل أو العزلة جزيرة العائد منخفض جدا. للأسف ، LCM لا تنتج الخلايا الحية للدراسات الفنية وقيمتها غير كافية عادة لتحليل البروتين. وبالتالي ، قد تستخدم LCM بالتوازي مع شركائنا كولاجيناز بروتوكول الهضم لاسترداد الجزر تكون الطريقة الأكثر فعالية لمعالجة العينات الجراحية.
عند جمع الأنسجة لعزلة الجزيرة من pancreatectomies جزئية ، من المهم أن تدرس بعناية التاريخ المريض السريرية والأيض الدولة. وقد يتأثر المريض مستأصل البنكرياس جزئيا حسب نوع 3C السكري ، أي مرض السكري الثانوي إلى اضطراب البنكرياس مما يؤدي إلى عملية جراحية 6. وكان من بين المرضى الذين خضعوا ل43 المشاركة في هذه الجراحة ادارتنا في عام 2010 ، 32 منهم كانوا غير مصابين بالبول السكري ، تتأثر 5 من مرض السكري من النوع 2 و 6 من النوع 3C السكري. هذه البيانات تتفق مع دراسات سابقة تشير إلى اختلال عملية التمثيل الغذائي ومرض السكري الجلوكوز في جزء كبير من المرضى الذين يعانون من سرطان البنكرياس أو التهاب البنكرياس المزمن 6. اعتبرنا أن مرض السكري المنشأ الأساسي إذا تم تشخيص ما لا يقل عن عام واحد قبل ظهور الأعراض التي تؤدي إلى جراحة البنكرياس 7. وينبغي أيضا على مستويات الأجسام المضادة ضد autoantigens جزيرة تقاس لتقييم الأصل الذاتية المحتملة للمرض السكري 8. لأن المريض يمكن أن يمر استئصال البنكرياس يعانون من مرض السكري دون تشخيص أو أن يكون الجلوكوز التعصب ، ينبغي إعطاء جميع المرضى غير المصابين بالبول السكري an تحمل الغلوكوز الفموي اختبار مسبق لاستئصال البنكرياس 9.
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
نريد ان نشكر العديد من زملائنا الذين قدموا المساعدة والمشورة والمدخلات الحاسمة في مختلف مراحل المشروع. وأيد الإنتاج من هذه المادة الفيديو مع أموال من وزارة البيئة الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF) إلى المركز الألماني لأبحاث السكري (DZD ، http://www.dzd-ev.de ) ، IMIDIA ( http://www . imidia.org ) ومستشفى جامعة كارل غوستاف كاروس في جامعة دريسدن التقنية. تلقى البحوث المؤدية إلى هذه النتائج على تمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) للمبادرة مبتكرة في إطار منحة الطب الاتفاق رقم 115005.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم | شركة | فهرس العدد | |
---|---|---|---|
معدات | |||
1 مل المصلية ماصة (CELLSTAR) | غرينر الحيوي واحد | 604181 | |
10 مل المصلية ماصة (CELLSTAR) | غرينر الحيوي واحد | 607180 | |
25 مل المصلية ماصة (CELLSTAR) | غرينر الحيوي واحد | 760180 | |
الحقنة 10 مل | دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) | 300912 | |
الحقنة 50 مل | دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) | 300865 | |
5 مل الحقنة | دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) | 309050 | |
18 G 1،1 / 2 إبرة Microlance 3 | دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) | 304622 | |
GX1 27 / 2 إبرة | براون | 4658300 | |
Gx3 27 / 4 Microlance الإبرة 3 | دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) | 302200 | |
3 خلية ثقافة الطول طبق 2X2 ملم الشبكة | نونك | 174926 | |
20 سم صحن زراعة الأنسجة | دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) | 353003 | |
6 سم سهلة طبق بتري قبضة | دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) | 351016 | |
150 مل زجاجة التخزين | كورننغ إنكوربوريتد | 431175 | |
250 مل مخروطي قوارير | شوت دوران | 21 217 36 | |
500 مل مخروطي قوارير | شوت دوران | 21 217 44 | |
250 مل مخروطية كاب برغي أسفل أنبوب جهاز طرد مركزي | كورننغ إنكوربوريتد | 430776 | |
50 مل أنبوب فالكون المخروطية | دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) | 352070 | |
260 مل Easyflask غير المعالجة | نونك | 156800 | |
Millex GV Duropore تصفية وحدة (0،22 ميكرون) | ميليبور | SLGV033RB | |
فراغ زجاجة الأعلى تصفية (PES القطر 70 ملم Membran ، 0،22 ميكرون حجم المسام ، و 45 مم حجم الرقبة ، و 500 مل حجم) | كورننغ إنكوربوريتد | 431118 | |
مقياس الكثافة (Densito 30PX) LWE37463 | Mettler توليدو | 51324450 | |
سريع وحدة تصفية PES 0،2 ميكرون | Nalgene | 569-0020 | |
لفائف التدفئة | BioRep تكنولوجيز شركة | HC - 02 | |
4 Multifuge KS - R | هيراوس | 75015680 | |
مضخة الطباع PD5206 | Heidolph | 523-52060-00-2 | |
Ricordi الغرفة (شبكة معدنية بقطر 600 ميكرومتر مسام) | BioRep تكنولوجيز | نموذج 50 - U - 01 ، 0503-001 التسلسلي | |
إعداد الجناح | BioRep تكنولوجيز | 50 - PS - 01 | |
O - خواتم | BioRep تكنولوجيز | OR - 50 - U - 01 | |
الرخام نتريد السيليكون (15 مم مجموعة من 9) | BioRep تكنولوجيز | SN - 01 | |
أنابيب السيليكون | Tygon | R 3603 8،0 X4 ، 0 ملم | |
ملقط جراحي | براون | BD168R | |
مقص جراحي (Aesculap) | براون | BC273R | |
حمام الماء شريان الحياة للسودان 200 | منح | 200 عملية شريان الحياة | |
الكواشف | |||
كولاجيناز -- RI Liberase> (100 ملغ) | روش | 11815032001 | |
D (+) - الجلوكوز | ميرك | 1.08337.1000 | |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | ميرك | 1.16743.1000 | |
Diphenylthiocarbazone (DTZ) | سيغما الدريتش | D5130 | |
الدناز I (100 ملغ) | روش | 10104159001 | |
Dulbeccos 1xPBS | PAA مختبرات | H15 - 002 | |
Electrolytsolution E154 | Serumwerk | 00509 | |
الجنين مصل البقر (FBS) | PAA مختبرات | A15 - 101 | |
Ficoll 400 | سيغما الدريتش | F9378 | |
Foetal المصل البقري (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
2 -- (4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) -- 1 - piperazinyl) - ethansulfons ‰ لدى عودتهم (HEPES) | روث | 9105.3 | |
هيدروكسيد الصوديوم ، 5 م | قسم الصيدلة السريرية ، والمستشفيات | -- | |
البنسلين / الستبرتوميسين (100X) | PAA مختبرات | P11 - 010 | |
Pipettaid (EXPRESS) | دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) | 357591 | |
Potassiumchlorid | Fluka | 60132 | |
Potassiumdihydrogenphospate اللامائية | JT بيكر | 0241 | |
Potassiummonohydrogenphosphate | JT بيكر | 3246-01 | |
RPMI متوسطة 1640 [--] مد الجلوكوز [+] L - الجلوتامين | Gibco | 11879-020 | |
RPMI متوسطة 1640 [+] L - الجلوتامين | PAA مختبرات | E15 - 840 | |
Sodiumhydrogencarbonat | ميرك | 1.06329.0500 |
وسائل الإعلام وحلول
Dithizone الحل
انزيم الحل
غسل وسائل الإعلام (1000ml/5.5mM الجلوكوز)
جزيرة الثقافة وسائل الإعلام (500ml / 5،5 ملي مول جلوكوز)
اليورو كولينز الحل
Ficoll ألبوم الحل
Ficoll التدرجات
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved