부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

요약

연구 2 형 당뇨병 아일 레츠의 공급 부족이다. 여기 부분 pancreatectomy를 겪고 환자에서 아일 레츠를 분리를위한 프로토콜을 공유할 수 있습니다. 이 방법은 제 2 형 당뇨병 환자에서 아일 레츠을 얻기위한 독특한 장소를 나타내며 임상 기초 및 임상 연구에 적합한 숫자가 아닌 당뇨병 과목과 일치.

초록

2 형 당뇨병과 Langerhans 고장 ¹ 아일 레츠의 pathogenesis에 수사가 장기 기증자 ² 제 2 형 당뇨병 아일 레츠의 제한된 가용성에 의해 방해되었다. 우리가 제 2 형 당뇨병 및 다른 췌장 질환 (양성 또는 악성 췌장 종양, 만성 췌장염, 그리고 일반적인 담즙 덕트 또는 십이지장 종양)으로 인해 부분 pancreatectomy을받은 비 당뇨병 환자에서 얻은 인간의 췌장 조직에서 아일 레츠를 분리를위한 프로토콜을 공유 . 관련이있는 모든 환자는 또한 지역 윤리위원회의 승인을했다이 연구에 그들의 동의했다. 수술 표본은 즉시 진단 목적으로 손상된 조직을 유지, 아일릿 절연을위한 부드럽고 건강한 나타나는 췌장 조직을 선택한 병리학자에게 전달했다. 우리는 1,000 명 이상의 아일 ​​레츠를 분리 발견, 우리는 췌장 조직의 최소 2g으로 시작했다. 우리 프로토콜에 또한 필수이 효소 함유 미디어를 주입하면 가시 조직을 넓히다하고 이후 표면 영역을 증가시켜 소화를 돕기 위해 그것을 말하다하는 것이었다.

인간의 췌장 조직의 대량 (> 15g)을 사용할 수있는 가끔 사건을 포함하기 위해 프로토콜의 적용을 확장하기 위해, 우리는 조직을 소화 Ricordi 챔버 (50 ML)을 사용합니다. 소화하는 동안, 우리는 수동으로 조직 섬유증이 자사의 수준에 따라 표본의 다양한 강도에 Ricordi 챔버 ³ 흔들었다. discontinous Ficoll 기울기는 다음 acinar 조직에서 아일 레츠를 구분하는 데 사용되었다. 우리는 조직 펠렛은 homogenously 1.125 g / ML의 밀도 Ficoll 매체에 resuspended 수있을 정도로 작은되어야한다고 지적했다. 분리 후, 우리는 그들의 기능 회복을 촉진하기 위해 최소 48 H에 대한 37 5 % CO _2와 스트레스 무료 조건 (없음 흔들림이나 회전) ° C에서 아일 레츠을 배양해. 우리 프로토콜 및 향후 개선의 광범위한 응용 프로그램은 크게 2 형 당뇨병 연구를 발전, 당뇨병에서 인간 아일 레츠 다량의 적시에 수확 및 임상 일치하지 않는 당뇨병 과목을 사용 수 있습니다.

프로토콜

1. 수술실에 췌장 조직 모음

1. 외과는 췌장의 부분 절제술을 수행합니다.
2. 얼음 상자에 췌장 표본을 배치 후, 병리학자에게 즉시 제공합니다.

2. 아일릿 격리에 대한 조직 선택

1. 병리학자는 진단 목적으로 손상된 조직을 유지, 부드럽고 건강한 나타나는 조직을 선택합니다. Fibrotic 조직과 유용성을 조직 미만 2g을 제공하는 표본은 아일릿 격리에서 제외됩니다.
2. 유로 콜린스 솔루션의 췌장 조직을 담가와 실험실에 얼음 제공합니다.

3. 인간 아일 레츠의 분리

1. 췌장 조직의 무게를, 다음 10cm 접시에 넣습니다.
2. 500 ML 플라스크에 150 ML RPMI 미디어를 넣어.
3. 250 ML 플라스크에 100 MG / ML DNase 및 5mg/ml의 Liberase의 RI 20 ML 130 ML RPMI 미디어를 결합하여 소화 효소 솔루션을 준비합니다. 췌장 조직을 주입하는 주사기로이 솔루션의 10 ML을 그립니다.
4. homogeneously을 넓히다 목표로, 췌장 조직에 소화 효소 솔루션을 주사. 이것이 섬유증의 예방 경우, 소화 가능성이 높습 실패합니다. 다음 ~ 4mm에 얼음 ³ 조각을 조직을 말하다.

4. 인간 췌장의 소화 회로

1. 그림 1에서와 같이 소화 회로를 조립. Ricordi 챔버의 흐름 방향은 챔버의 상단에 아래와 밖에서 있습니다.
2. 300 ML 총 볼륨에 500 ML 플라스크에 남아있는 소화 효소 솔루션을 추가하고 온도계를 삽입합니다.
3. , 챔버에 췌장 조직을 전송 메쉬 (구멍 지름 : 600 μm의)를 삽입 세 실리콘 질화물 구슬 (직경 : 15mm)는 챔버를 닫고 140 ML / 분 설정 흐름과 펌프를 시작합니다.
4. 회로의 온도가 37에 도달하면 ° C, 타이밍을 시작하고 정기적으로 소화를 중지 시기를 결정하는 샘플을 채취. dithizone (2 MG / ML)로 얼룩하면 소화 조직 ⁴ 시간 아일 레츠의 미세한 시각화 수 있습니다.
5. 아일 레츠가 주변 acinar 조직에서 분리되면, 얼음에 가열 코일을 배치하고 회로에 감기 세척 미디어 200 ML (5.5 MM 포도당와 10 % FBS와 900 ML RPMI 1640)를 추가하여 소화를 빠르게를 중지합니다.
6. 이 샘플 튜브 나오는 등 250 ML 원뿔 튜브에 아일릿 솔루션을 수집합니다. 회로가 비어 때까지 계속합니다.

그림 1. 세 실리콘 질화물 구슬 (직경 : 15mm) : 인간의 췌장의 소화 회로는 인간의 췌장의 소화 회로는 메쉬 (600 μm의 구멍 직경)이있는 Ricordi 챔버를 포함합니다. 챔버의 유출은 연동 펌프 (140 ML / 분)에 의해 조직 수집 플라스크로 구동됩니다. 화살표는 흐름 방향을 나타냅니다. 효소 소화를위한 최적 온도는 37 ° C의 물을 욕조에 가열 코일을 immersing에 의해 유지됩니다.

5. 포스트 소화를 워싱

1. 5 분 1,000 RPM에서 아일릿 솔루션 4 ° C를 포함하는 250 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기.
2. 뜨는을 취소 (5.5 MM 포도당와 10 % FBS와 900 ML RPMI 1640) 씻어 미디어 아일릿 펠렛을 resuspend 50 ML 원뿔 튜브와 같은 분수에 배포할 수 있습니다. (옵션 :. 세탁 개선하기 위해 추가적인 원뿔 튜브로 배포) 1,000 rpm으로 원심 분리기, 5 분 4 ° C.
3. 뜨는 취소 부드럽게 흔들어 수동으로 알약을 푸세요.

6. Ficoll 기울기에 정제

1. 1.125 g / ML, 산도 7.4의 밀도에 Ficoll 미디어 펠렛을 Resuspend 천천히 1.080, 1.060 및 1.037 g / ML의 밀도와 Ficoll 미디어 10 ML aliquots를 오버레이.
2. 20 분 4 ° C, 2400 RPM에서 Ficoll 그라디언트를 원심 분리기.

7. 아일릿 컬렉션과 문화

1. 원심 분리 후, 다른 조직 구성 요소는 그라데이션에서 파티션으로 구분할 수 있습니다.
2. 지방과 결합 조직으로 구성된 상위 레이어를 폐기하십시오.
3. 조심스럽게 1.037-1.060 g / ML 계면에서 아일릿 집계의 첫 번째 계층은 수확. 이 계층은 가장 순수 분리된 아일 레츠가 포함되어 있습니다. 효율적인 고립을 위해 별도로 분수를 수집합니다.
4. 1.060-1.080 g / ML 계면에서 아일릿 집계의 두 번째, 덜 순수 분수를 수집합니다.
5. 50 ML의 총 볼륨 각 원뿔 튜브로 (5.5 MM 포도당와 10 % FBS와 900 ML RPMI 1640)을 씻어 미디어를 추가하여 Ficoll 그라디언트를 희석. 1,000 rpm으로 원심 분리기, 5 분 4 ° C.
6. 흡입하여 뜨는 폐기하십시오. 펠렛은 Ficoll 기울기로 풀어 인해 수도로주의를 기울이시기 바랍니다.
7. 알약 WI 와시회 세척 미디어 (5.5 MM 포도당와 10 % FBS와 900ml RPMI 1640) 1000 rpm으로 원심 분리기, 4 명이 5 분 C. 아일릿 문화 매체를 사용하여 반복
8. 문화 미디어에서 아일 레츠를 Resuspend 37에서 5 % CO ₂ 배양기에서 그들을 자리 ° C를 추가로 처리하기 전에 24~48시간하십시오.

결과

이것은 크게 크게 섬유증 및 collagenase 활동의 차이로 인해 준비 사이의 다양한 있지만, 우리의 프로토콜, 췌장 조직 g 당 500 ~ 아일 레츠의 평균이 나왔고. 그러면 그들에게 고립 후 24 시간 handpicking, 조직을 처리하는 동안 Dithizone 처음에 얼룩으로> 90 % 아일릿 순도를 달성했습니다. 정화 아일 레츠의 품질을 결정하기 위해, 우리는 2 시간 정적 조건에서 25 mm까지 포도당 자극 인슐린 분비에 대한 검사. 우리는 ECIT 아일릿 절연 및 이식 센터에서 얻은 아일 레츠의 위해 인슐린 분비가 비교 발견했습니다. 부분적으로 pancreatectomized pancreata으로부터 격리 아일 레츠는 아일릿 이식, 중요한 요인으로 간주 아니었 전체 IEQ 평가를 위해 의미되지 않습니다로.

중요한 것은 우리의 방법은 우리가 2005 년과 2008 ⁵ 사이의 25 부분 pancreatectomized 환자의 기능 연구 아일 레츠를 분리 수있었습니다. 이 아일 레츠는 서양의 모래 바닥과 immunohistochemistry으로 포도당 자극 인슐린 분비와 특정 단백질 표현 분석했다. 부분적으로 pancreatecomized pancreata으로부터 격리 아일 레츠는 유전자 및 단백질 발현 프로파일, ultrastructural 모양과 비 당뇨병과 당뇨병 아일 레츠의 기능 반응을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 장기 기증자가보다 부분 pancreatectomy을받은 많은 환자가 있기 때문에, 우리 프로토콜은 충분한 샘플 데이터는 강력한 통계 분석을 위해 수집하는 허용할 수 있습니다.

토론

우리의 프로토콜을 사용하여, 인간 아일 레츠는 부분 pancreatectomy에서 수집한 췌장 조직으로부터 격리 수 있습니다. 이 프로토콜의 성공은 몇 가지 중요한 점 중에 찍은 치료에 의존합니다. 베타 세포 생존을 유지하기 위해서는 시편이 실험실에 얼음에 신속하게 수송하는 것이 중요합니다. 또한, 조직 소화 기간은 조직 섬유증과 미디어의 효소 활동의 등급에 따라 경험적으로 최적화해야합니다. 이것은 Ricordi 챔버 수동으로 적용 기계 강제의 정도에도 마찬가지입니다. 따라서 좋은 아일릿 수율을 얻기 위해, 프로토콜은 최고의 헌신적인 과학자 또는 기술적 보조에 의해 수행됩니다. 팀 이미 아일릿 격리 경험하지 않는 초기 실패 표준입니다.

우리 아일릿 격리 프로토콜과 표준 인간 아일릿 절연 방법 사이의 주요 차이점이 있습니다 : 우리가 수술 도중에 국소 빈혈의 몇 시간의 대상이 췌장 조직을 사용하지만 1), 그것은 즉시 사이트에 처리됩니다. 이것은 할당과 아일릿 격리 시설에 전달하는 동안 몇 시간 동안 허혈성 남아있는 췌장 / 아일릿 이식을위한 뇌사 기증자에서 explanted pancreata에 대비하고 있습니다. 표준 프로토콜은 췌장 덕트에 그것을 불어 넣다하는 반면, 2) 우리는 직접 췌장 조직으로 collagenase를 주입. 3) 우리는 대신 COBE 셀 프로세서를 사용하여 지속적인 Ficoll 기울기에서 아일 레츠를 수집 불연속 Ficoll 기울기를 사용하여 아일 레츠를 구분한다.

수술 표본이 너무 fibrotic 또는 아일 레츠의 적절한 숫자를 분리를위한 부족의 경우, 조직은 여전히 레이저 캡처 microdissection (LCM) ¹⁰ 검색될 수 있습니다. 이것은 아일릿 격리가 실패하거나 생산량이 매우 낮은 경우에도 유전자 표현 데이터는 거의 모든 시료에서 복구할 수 있습니다. 불행하게도, LCM은 기능 연구 살아있는 세포를 생산하지 않는 그들의 금액은 proteomic 분석을 위해 일반적으로 부족합니다. 따라서 아일 레츠를 검색하기 위해 collagenase의 소화 프로토콜과 병행하여 LCM을 사용하면 수술 표본을 처리하는 가장 효과적인 방법이 될 수 있습니다.

부분 pancreatectomies에서 아일릿 고립에 대한 조직을 수집하면, 그것은 환자의 임상 기록과 신진 대사 상태를 자세히 조사하는 것이 중요합니다. 부분 pancreatectomized 환자는 유형 3C 당뇨병, 수술 ⁶ 이어지는 췌장 장애로 보조 즉, 당뇨병에 의해 영향을받을 수 있습니다. 2010 년 본학과에서 수술을 받았습니다 43 참여 환자 중 32 비 당뇨병 있었다 5 2 형 당뇨병 및 6에 의해 영향을 받았다고하는 것은 유형의 3C 당뇨병을했다. 이러한 데이터 손상 포도당 대사 및 췌장암이나 만성 췌장염 ⁶ 고통 환자의 상응하는 소수의 당뇨병 환자를 가리키는 이전 연구에 동의합니다. 그것이 췌장 수술 ⁷ 주요 증상하기 전에 적어도 한 해에 아빠가 진단을 받으 셨어면 우리는 기본 기원하는 당뇨병으로 간주. 아일릿 autoantigens에 대한 항체의 수준은 또한 당뇨병 ⁸ 잠재적인 면역 출처를 평가하는 측정해야합니다. pancreatectomy을받은 환자가 undiagnosed 당뇨병으로 고생하거나 포도당 긴거 수 있기 때문에 이외의 모든 당뇨병 환자는 이전 pancreatectomy ⁹ 경구 포도당 내성 테스트를 제공한다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
이름	회사	카탈로그 번호
장비
1 ML serological 피펫 (CELLSTAR)	그라 이너 바이오 - 원	604181
10 ML serological 피펫 (CELLSTAR)	그라 이너 바이오 - 원	607180
25 ML serological 피펫 (CELLSTAR)	그라 이너 바이오 - 원	760180
10 ML 주사기	BD (백톤, 디킨슨과 회사)	300912
50 ML 주사기	BD (백톤, 디킨슨과 회사)	300865
5 ML 주사기	BD (백톤, 디킨슨과 회사)	309050
18 G 1,1 / 2 니들 Microlance 3	BD (백톤, 디킨슨과 회사)	304622
27 Gx1 / 2 니들	브라운	4,658,300
27 Gx3 / 4 니들 Microlance 3	BD (백톤, 디킨슨과 회사)	302200
3cm의 세포 배양 접시의 2x2 mm 그리드	Nunc	174926
20cm 조직 문화 요리	BD (백톤, 디킨슨과 회사)	353003
6cm 쉬운 그립 페트리 접시	BD (백톤, 디킨슨과 회사)	351016
150 ML 저장 병	코닝 법인	431175
250 ML Erlenmeyer flasks	쇼트 듀란	21 217 36
500 ML Erlenmeyer flasks	쇼트 듀란	21 217 44
250 ML 스크류 캡 코니컬 히프 원심 분리기 튜브	코닝 법인	430776
50 ML 팰컨 원뿔 관	BD (백톤, 디킨슨과 회사)	352070
260 ML Easyflask 비 - 대우	Nunc	156800
Millex GV 필터 유니트 Duropore (0,22 μm의)	Millipore	SLGV033RB
필터 바틀 톱 진공 (PES 70mm 직경 Membran, 0,22 μm의 기공 크기, 45mm 넥 크기, 500 ML 볼륨)	코닝 법인	431118
밀도계 (Densito 30PX) LWE37463	메틀러 톨레도	51324450
빠른 PES 필터 유니트 0,2 μm의	Nalgene	569-0020
가열 코일	BioRep 기술 병원	HC - 02
Multifuge 4 KS - R	Heraeus	75015680
펌프 일반 PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordi 챔버 (600 μm의 기공 직경 금속 메쉬)	BioRep 기술 주식 회사	모델 50 - U - 01, 시리얼 0503-001
준비 스탠드	BioRep 기술 주식 회사	50 PS - 01
O - 링	BioRep 기술 주식 회사	또는 - 50 - U - 01
실리콘 질화물 구슬 (9 15mm 세트)	BioRep 기술 주식 회사	SN - 01
실리콘 튜브	Tygon	R 3603 8,0 X4, 0mm
외과 포셉	브라운	BD168R
외과 가위 (Aesculap)	브라운	BC273R
워터 욕조 200 OLS	부여	OLS 200
시약
Collagenase -> Liberase의 RI (100 MG)	로체	11815032001
D (+) 포도당	머크	1.08337.1000
Dimethylsulfoxide (DMSO)	머크	1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone (DTZ)	시그마 알드리치	D5130
DNase I (100 MG)	로체	10104159001
Dulbeccos 1xPBS	PAA Laboratories의	H15 - 002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00,509
태아 소 혈청 (FBS)	PAA Laboratories의	A15 - 101
Ficoll 400	시그마 알드리치	F9378
Foetal 소 혈청 (FBS)	Gibco	10270-106
2 - (4 - (2 - 히드록시 에틸) - 1 piperazinyl) ethansulfons ‰ 우레 (HEPES)	로스	9105.3
NaOH, 5 M	임상 약국, 병원	-
페니실린은 / 스트렙토 마이신 (100x)	PAA Laboratories의	P11 - 010
Pipettaid (특급)	BD (백톤, 디킨슨과 회사)	357591
Potassiumchlo​​rid	Fluka	60,132
Potassiumdihydrogenphospate 무수	JT 베이커	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JT 베이커	3246-01
RPMI 중간 1640 [-] D - 포도당 [+] L - 글루타민	Gibco	11879-020
RPMI 중간 1640 [+] L - 글루타민	PAA Laboratories의	E15 - 840
Sodiumhydrogencarbonat	머크	1.06329.0500