部分的に膵臓を摘出された患者からのヒト膵島の単離

要約

研究のための2型糖尿病膵島の供給が不十分です。ここでは、膵部分切除を受けた患者からの膵島を単離するための我々のプロトコルを共有しています。このアプローチは、2型糖尿病と基礎および臨床研究のための十分な数の臨床的にマッチした非糖尿病患者からの膵島を得るためのユニークな会場を表します。

要約

2型糖尿病とランゲルハンス故障¹の島の病因の調査は、臓器提供者²からの2型糖尿病膵島の限られた可用性によって妨げられている。ここでは、2型糖尿病と異なる膵疾患（良性または悪性膵腫瘍、慢性膵炎、および総胆管や十二指腸腫瘍）による膵部分切除を受けた非糖尿病患者から得られたヒト膵組織からの膵島を単離するための我々のプロトコルを共有する。関係するすべての患者はまた、地元の倫理委員会によって承認されていたこの研究に同意を与えた。手術標本は、直ちに診断目的のために損傷した組織を維持し、膵島分離のために柔らかで健康的に出現する膵組織を選択した病理医に届けられました。我々は1,000以上の島を分離することがわかった、我々は、膵組織の少なくとも2gを開始しなければならなかった。我々のプロトコルにも不可欠の酵素含有培地を注入するときに目に見えて組織を膨張させると、続いて表面積を増やすことによって消化を助けるためにそれをミンチにしました。

ヒト膵臓組織の大量（> 15グラム）が使用できる偶発症例を含めるために、我々のプロトコルの適用性を拡張するために、我々は組織を消化するためにRicordiのチャンバー（50ml）を使用。消化中に、我々は、手動で組織の線維化のそのレベルに応じて試料によって変化する強度でRicordiのチャンバ^3を横に振った。不連続フィコール勾配は、その後、腺房組織から膵島を分離するために使用されていました。我々は、組織ペレットが均一に1.125グラム/ mlの密度でフィコール培地に再懸れるのに十分小さくする必要があることに注意。単離後、我々は彼らの機能回復を促進するために、少なくとも48時間、37時、5％CO ₂でストレスフリーの条件（無揺れや回転）° C下で膵島を培養。我々のプロトコルとその将来の改良の広範なアプリケーションが大幅に2型糖尿病の研究を進め、糖尿病と臨床的にマッチした非糖尿病患者からヒト膵島の大量のタイムリーな収穫を有効にすることができます。

プロトコル

1。手術室における膵組織のコレクション

1. 外科医は、膵臓の部分切除を行います。
2. 氷の上にボックスで膵臓試料を配置した後、病理医にすぐにそれを提供します。

2。膵島分離のための組織の選択

1. 病理医は、診断目的のために損傷した組織を維持し、柔らかで健康的に表示される組織を選択します。線維化組織と使用可能な組織の未満2gを提供する標本は膵島分離から除外されます。
2. ユーロコリンズ液における膵組織を浸漬し、実験室に氷の上で実現。

3。ヒト膵島の単離

1. 膵臓の組織を比較検討し、10cmの皿に入れてください。
2. 500mlのフラスコに150ミリリットルRPMI培地を入れて。
3. 250mlのフラスコに、100 mg / mlのDNaseおよび5mg/mlリベラーゼRIの20mlで130ミリリットルRPMI媒体を組み合わせることにより、消化酵素溶液を調製。膵臓の組織を注入するシリンジにこの溶液10mlを描く。
4. 均一に膨張させることを目指し、膵組織に消化酵素溶液を注入。これは線維化が禁止されている場合は、消化が失敗する可能性があります。次に、〜4ミリメートル氷の上に^3つの部分にティッシュを飾らない。

4。ヒト膵臓の消化回路

1. 図1に示すように、消化の回路を組み立てます。 Ricordiのチャンバ内の流れ方向は、チャンバーの上部の底とアウト時になります。
2. 300mlの総容積を500 mlのフラスコに、残りの消化酵素溶液を追加し、温度計を挿入する。
3. 、チャンバー内に膵組織を転送するメッシュ（孔径：600μm）を挿入する三窒化ケイ素ビー玉（直径：15 mm）を、チャンバーを閉じ、140ml /分で設定流量でポンプを起動します。
4. 回路の温度が37℃に達すると、タイミングを開始し、定期的に消化を停止する時期を決定するためにサンプルを取る。ジチゾン（濃度2μg/ ml）で染色すると消化された組織⁴内の膵島の微視的な可視化が可能になります。
5. 小島が周囲の腺房組織から分離されると、氷の上で加熱コイルを配置し、回路へのコールド洗浄媒体200mlの（5.5 mMグルコース及び10％FBSと900ミリリットルRPMI 1640）を追加することで消化を迅速に停止する。
6. それはサンプルチューブから出てくると250 mlコニカルチューブに膵島ソリューションを収集する。回路が空になるまで続けます。

図1。三窒化ケイ素のビー玉（直径：15ミリメートル）： ヒト膵臓の消化回路は、ヒト膵臓の消化回路は、メッシュ（600μmの孔径）を含むRicordiのチャンバーが含まれています。チャンバーからの流出は、蠕動ポンプ（140ml /分）により、組織のコレクションのフラスコに駆動されます。矢印は流れ方向を示している。酵素消化のための最適温度は37℃の水浴中で加熱コイルを浸漬することにより維持されています。

5。後の消化を洗浄

1. 5分間1000rpmで膵島ソリューション、4 ° Cを含む250ミリリットルコニカルチューブを遠心する。
2. 上清を捨て、（5.5 mMグルコース及び10％FBSを900ミリリットルRPMI 1640）洗浄媒体の膵島ペレットを再懸濁し、50 mlコニカルチューブに等しい分数にそれを配布する。 （オプション：洗濯を向上させるために追加のコニカルチューブに配布します。）遠心は1000rpmで、4℃で5分間Cを。
3. 上清を捨て、軽くマニュアル揺れによってペレットを緩めます。

6。フィコール勾配で精製

1. 1.125グラム/ mlの、pH7.4の密度でフィコールメディアでペレットを再懸濁し、ゆっくり1.080、1.060および1.037グラム/ mlの密度でフィコールメディアを10mlのアリコートを重ねます。
2. 20分間4℃、2400 rpmでフィコール勾配を遠心分離します。

7。膵島コレクションと文化

1. 遠心分離後、別の組織成分は勾配で、そのパーティションで区別することができます。
2. 脂肪と結合組織から成る上部層を捨てる。
3. 慎重に1.037〜1.060グラム/ mlの相間での膵島集合体の最初の層を収穫。この層は最も純粋な孤立した島が含まれています。効率的な分離のために別々の画分を集める。
4. 1.060〜1.080グラム/ mlの間期における膵島集合体の第二、少ない純粋なフラクションを集める。
5. 50mlの合計量にそれぞれのコニカルチューブに（5.5 mMグルコース及び10％FBSを900ミリリットルRPMI 1640）を洗浄するメディアを追加することにより、フィコール勾配を希釈する。 1000rpmで遠心、5分間4℃。
6. 吸引により上清を捨てる。ペレットはルーズフィコール勾配が原因である可能性があるので注意してください。
7. ペレットwiを洗う番目の洗浄媒体（5.5 mMグルコース、10％FBSと900ミリリットルRPMI 1640）と1000 rpmで遠心、4℃で5分間。膵島培養培地を用いて繰り返す
8. 培地で島を再懸濁し、37℃5％CO ₂でインキュベーターの中に置いてください° Cをさらに処 ​​理する前に、24〜48時間。

結果

これは非常に大きく線維化とコラゲナーゼ活性の違いに起因する準備の間で変化が我々のプロトコルには、膵組織のグラムあたり〜500膵島の平均が得られた。私たちは、その後24時間分離した後、それらをhandpicking、組織の処理中に、ジチゾンを持つ最初の染色により> 90％の膵島の純度を達成しました。精製された膵島の品質を決定するために、我々は、2時間静置条件下で25 mMのグルコース刺激によるインスリン分泌のためにテストされています。我々はECIT膵島分離および移植センターから得られた島に匹敵するインスリンの分泌を発見した。部分的に膵臓を摘出された膵臓から分離された島が膵島移植のために意味されないので、合計IEQのアセスメントは重要な要因であると考えられていなかった。

重要なことは、私たちの方法は、私たちは2005年から2008年^5〜25部分的な膵臓を摘出された患者からの機能研究のために膵島を分離することができました。これらの島は、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学によってグルコース刺激インスリン分泌および特定のタンパク質の発現について分析した。部分的にpancreatecomized膵臓から分離した膵島を、また、非糖尿病および糖尿病膵島の超微細構造外観と機能的反応を遺伝子やタンパク質発現プロファイルを比較するために使用することができる。臓器のドナーが存在するよりも、膵部分切除を受けて、より多くの患者が存在するため、我々のプロトコルは、十分なサンプルとデータを堅牢な統計分析のために収集される可能性があります。

ディスカッション

私たちのプロトコルを使用して、ヒト膵島は、膵部分切除から収集した膵臓組織から単離することができる。このプロトコルの成功は、いくつかの重要なポイントの間に取られた心配に依存しています。 β-細胞生存率を維持するために、それは、試験片を実験室に氷上で急速に輸送されることが不可欠です。さらに、組織の消化の期間は、組織の線維化とメディアの酵素活性の等級に応じて経験的に最適化する必要があります。これはRicordiのチャンバーに手動で適用される機械的な力の程度についても同様です。したがって、良好な膵島収量を得るために、プロトコルは最適​​な、専用の科学者や技術アシスタントによって実行されます。チームはすでに膵島分離に経験されていない限り、初期不良が主流です。

私たちの膵島分離プロトコルと標準的なヒト膵島分離法の主な違いがあります：1）我々は手術中に虚血の数時間を受けた膵臓組織を使用していますが、それはすぐにサイト上で処理されますが。これは、割り当ておよび膵島分離施設への納入時に数時間のために虚血性のまま膵臓/膵島移植のための脳死患者からの外植膵臓とは対照的です。標準プロトコルは、膵管にそれを注入することであるのに対し、2）我々は、膵臓の組織に直接コラゲナーゼを注入する。 3）我々は、代わりにCOBEセルのプロセッサを使用して連続フィコール勾配から膵島を集めるの不連続フィコール勾配を使って島を区切ります。

手術標本があまりにも線維性または膵島の十分な数を単離するための不足しているケースでは、組織はまだレーザーキャプチャーマイクロダイセクション^（LCM）10によって取得することができます。これは、膵島分離に失敗した場合でも、遺伝子発現データは、ほぼすべての試料から回収することができますまたは収率が非常に低いです。残念ながら、LCMは、機能的な研究のために生きている細胞を生成しませんし、その量は、プロテオーム解析のための一般的には不十分である。このように、膵島を取得するために私たちのコラゲナーゼ消化プロトコルと並行してLCMを使用すると手術標本を処理するために最も効果的な方法かもしれない。

部分的pancreatectomiesからの膵島分離のために組織を収集する場合、それは患者の病歴や代謝の状態を慎重に調べることが重要です。部分的に膵臓を摘出された患者は、型3C糖尿病、手術⁶につながる膵臓疾患に続発すなわち糖尿病の影響を受ける可能性があります。 2010年に当科でこの手術を受けた43参加した患者のうち、32は非糖尿病だった、5は2型糖尿病の影響を受け、6種類3C糖尿病を持っていた。これらのデータは、グルコース代謝の障害と膵癌や慢性膵炎⁶から患っている患者のかなりの割合で糖尿病を指している以前の研究に同意する。それは膵臓の手術⁷につながる症状の発症前に少なくとも一年と診断された場合、我々は、一次起源であることが糖尿病を考慮。膵島自己抗原に対する抗体のレベルはまた、糖尿病⁸の潜在的な自己免疫の起源を評価するために測定する必要があります。膵切除術を受けた患者は、未診断の糖尿病を患うまたはグルコース不耐症になる可能性があるため、すべての非糖尿病患者は膵切除⁹以前に経口ブドウ糖負荷試験を付与する必要があります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
の名前	会社	カタログ番号
機器
1ミリリットル血清ピペット（CELLSTAR）	グライナーバイオワン	604181
10ミリリットル血清ピペット（CELLSTAR）	グライナーバイオワン	607180
25ミリリットル血清ピペット（CELLSTAR）	グライナーバイオワン	760180
10mlのシリンジ	BD（ベクトンディッキンソン社）	300912
50mlのシリンジ	BD（ベクトンディッキンソン社）	300865
5 mlのシリンジ	BD（ベクトンディッキンソン社）	309050
18 G 1,1 / 2ニードルMicrolance 3	BD（ベクトンディッキンソン社）	304622
27 GX1 / 2ニードル	ブラウン	4658300
27 GX3 / 4ニードルMicrolance 3	BD（ベクトンディッキンソン社）	302200
3cmの細胞培養ディッシュ2 × 2 mmの格子	ヌンク	174926
20cmの組織培養皿	BD（ベクトンディッキンソン社）	353003
6センチメートルイージーグリップのペトリ皿	BD（ベクトンディッキンソン社）	351016
150mlのストレージのボトル	コー​​ニングインコーポレイティッド	431175
250ミリリットルの三角フラスコ	ショットデュラン	21 217 36
500mlエルレンマイヤーフラスコ	ショットデュラン	21 217 44
250mlのスクリューキャップコニカル遠心分離管	コー​​ニングインコーポレイティッド	430776
50mlファルコンコニカルチューブ	BD（ベクトンディッキンソン社）	352070
260ミリリットルEasyflask非処理	ヌンク	156800
マイレクスGVフィルターユニットDuropore（0,22μM）	ミリポア	SLGV033RB
ボトルトップ吸引フィルター（PES 70ミリメートル直径Membran、0,22μmの孔径、45 mmの首のサイズ、500mLの容積）	コー​​ニングインコーポレイティッド	431118
濃度計（Densito 30pxの）LWE37463	メトラートレド	51324450
高速PESフィルターユニット0,2μmの	Nalgene	569-0020
加熱コイル	BioRepテクノロジーズ株式会社	HC - 02
Multifuge 4 KS - R	ヘレウス	75015680
ポンプ（標準）PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordiのチャンバー（600μmの孔径を持つ金属製のメッシュ）	BioRepテクノロジーズ株式会社	モデル50 - U - 01、シリアル0503から001
準備スタンド	BioRepテクノロジーズ株式会社	50 - PS - 01
O -リング	BioRepテクノロジーズ株式会社	OR - 50 - U - 01
窒化ケイ素のビー玉（9、15 mmのセット）	BioRepテクノロジーズ株式会社	SN - 01
シリコンチューブ	タイゴン	R 3603 8,0 X4、0ミリメートル
手術用鉗子	ブラウン	BD168R
外科はさみ（Aesculap）	ブラウン	BC273R
水浴OLS 200	グラント	OLS 200
試薬
コラゲナーゼ - >リベラーゼのRI（100 mg）を	ロッシュ	11815032001
D（+） - グルコース	メルク	1.08337.1000
ジメチルスルホキシド（DMSO）	メルク	1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone（DTZ）	シグマアルドリッチ	D5130
DNアーゼI（100 mg）を	ロッシュ	10104159001
Dulbeccos 1xPBS	PAA研究所	H15 - 002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00509
ウシ胎児血清（FBS）	PAA研究所	A15 - 101
フィコール400	シグマアルドリッチ	F9378
胎児ウシ血清（FBS）	ギブコ	10270-106
2 - （4 - （2 - ヒドロキシエチル） - 1 - ピペラジニル）- ethansulfons‰URE（HEPES）	ロート	9105.3
水酸化ナトリウム、5 M	臨床薬学、病院	-
ペニシリン/ストレプトマイシン（100倍）	PAA研究所	P11 - 010
Pipettaid（EXPRESS）	BD（ベクトンディッキンソン社）	357591
Potassiumchlo​​rid	フルカ	60132
Potassiumdihydrogenphospate無水	JTベイカー	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JTベイカー	3246〜01
RPMI培地1640 [ - ] D -グルコース[+] L -グルタミン	ギブコ	11879-020
RPMI培地1640 [+] L -グルタミン	PAA研究所	E15 - 840
Sodiumhydrogencarbonat	メルク	1.06329.0500