L'isolement des îlots humains à partir des patients partiellement pancréatectomisés

Résumé

L'alimentation de type 2 diabétiques îlots pour la recherche est insuffisant. Ici, nous partageons notre protocole pour isoler les îlots de patients subissant une pancréatectomie partielle. Cette approche représente un lieu unique pour obtenir des îlots de diabétiques de type 2 et cliniquement correspondance des sujets non diabétiques, en nombre suffisant pour les études fondamentales et cliniques.

Résumé

Les enquêtes sur la pathogenèse de diabète de type 2 et les îlots de Langerhans dysfonctionnement ¹ ont été entravés par la disponibilité limitée des îlots de diabète de type 2 à partir de ² donneurs d'organes. Ici, nous partageons notre protocole pour isoler les îlots de tissu pancréatique humaine obtenue à partir diabétiques de type 2 et les patients non diabétiques ayant subi une pancréatectomie partielle due à des maladies pancréatiques différentes (tumeurs pancréatiques bénignes ou malignes, la pancréatite chronique, et cholédoque ou de tumeurs duodénales) . Tous les patients concernés ont donné leur consentement à cette étude, qui avait également été approuvé par le comité d'éthique local. Les spécimens chirurgicaux ont été immédiatement remis à la pathologiste qui a choisi douce et saine du tissu pancréatique pour l'isolement des îlots apparaissant, en conservant les tissus endommagés à des fins diagnostiques. Nous avons constaté que d'isoler plus de 1.000 îlots, nous avons dû commencer avec au moins 2 g de tissu pancréatique. Également essentiel de notre protocole était d'visiblement distendre les tissus lors de l'injection des médias contenant des enzymes et ensuite on mâche pour faciliter la digestion en augmentant la surface.

Pour étendre l'applicabilité de notre protocole d'inclure le cas occasionnels dans lequel une grande quantité (> 15g) de tissu pancréatique humaine n'est disponible, nous avons utilisé une chambre de Ricordi (50 ml) pour digérer les tissus. Pendant la digestion, nous avons manuellement secoué la chambre Ricordi ³ à une intensité qui varie selon éprouvette en fonction de son niveau de fibrose des tissus. Un gradient discontinu de Ficoll a ensuite été utilisée pour séparer les îlots du tissu acineux. Nous avons noté que le culot de tissus devraient être assez petit pour être homogène en suspension dans un milieu de Ficoll avec une densité de 1,125 g / ml. Après isolement, nous avons cultivé des îlots dans des conditions sans stress (pas de secouer ou de rotation) avec 5% de CO ₂ à 37 ° C pendant au moins 48 h afin de faciliter leur récupération fonctionnelle. L'application généralisée de notre protocole et de son amélioration future pourrait permettre la récolte en temps opportun de grandes quantités d'îlots humains à partir diabétique et clinique correspond sujets non diabétiques, grandement progresser la recherche du diabète de type 2.

Protocole

1. Collecte de tissus pancréatiques dans la salle d'opération

1. Le chirurgien effectue une résection partielle du pancréas.
2. Après avoir placé le spécimen du pancréas dans une boîte sur la glace, le livrer immédiatement à l'anatomopathologiste.

2. Sélection de tissus pour l'isolement des îlots

1. Le pathologiste sélectionne tissu qui semble douce et saine, tout en conservant les tissus endommagés à des fins diagnostiques. Tissu fibreux et les spécimens offrant moins de 2 g de tissu utilisable sont exclus de l'isolement des îlots.
2. Immerger le tissu pancréatique en Euro Collins Solution et livrer sur la glace au laboratoire.

3. L'isolement des îlots humains

1. Peser le tissu pancréatique, puis le placer dans un plat de 10 cm.
2. Mettez 150 ml de RPMI médias dans un flacon de 500 ml.
3. Dans un flacon de 250 ml, préparer la solution d'enzymes digestives en combinant 130 ml de RPMI médias avec 100 mg / ml et 20 ml de DNase de RI Libérase 5mg/ml. Draw 10 ml de cette solution dans une seringue pour injecter le tissu pancréatique.
4. Injecter la solution d'enzymes digestives dans les tissus du pancréas, visant à la dilater de façon homogène. Si cela est empêché par la fibrose, la digestion sera probablement échouer. Ensuite, émincer les tissus dans ~ 4 mm ³ pièces sur la glace.

4. Homme circuit de la digestion du pancréas

1. Assemblez le circuit de digestion comme le montre la figure 1. La direction du flux dans la chambre de Ricordi est dans le bas et dehors au dessus de la chambre.
2. Ajouter la solution d'enzymes digestifs restant dans le ballon de 500 ml pour un volume total de 300 ml et insérer un thermomètre.
3. Transfert du tissu pancréatique dans la chambre, insérer le treillis (diamètre des pores: 600 um) et trois billes nitrure de silicium (diamètre: 15 mm), à proximité de la chambre et démarrer la pompe avec le flux fixé à 140 ml / min.
4. Lorsque la température du circuit atteint 37 ° C, commencer à chronométrer et périodiquement prélever des échantillons afin de déterminer quand arrêter la digestion. Coloration à la dithizone (2 mg / ml) permet la visualisation microscopique des îlots au sein du tissu digéré ^4.
5. Une fois les îlots sont séparés du tissu acineux environnantes, arrêter rapidement la digestion en plaçant la bobine de chauffage sur la glace et ajouter 200 ml de milieu lavage à froid (900 ml de RPMI 1640 avec 5,5 mM de glucose et 10% de FBS) pour le circuit.
6. Recueillir la solution îlot dans 250 ml tubes coniques comme elle sort du tube échantillon. Continuez jusqu'à ce que le circuit est vide.

Figure 1. Le circuit de pancréas humain la digestion Le circuit pancréas humain de digestion comprend une chambre de Ricordi contenant mailles (diamètre des pores: 600 um) et trois billes de nitrure de silicium (diamètre: 15 mm). Les sorties de la chambre est entraîné dans la fiole de collecte des tissus par la pompe péristaltique (140 ml / min). Les flèches indiquent la direction du flux. Une température optimale pour la digestion enzymatique est maintenue en immergeant le serpentin de chauffage dans un bain d'eau à 37 ° C.

5. Lavage après la digestion

1. Centrifuger les tubes coniques de 250 ml contenant la solution îlot à 1000 rpm, 4 ° C pendant 5 min.
2. Jeter le surnageant, resuspendre le culot îlot au milieu de lavage (900 ml de RPMI 1640 avec 5,5 mM de glucose et 10% de FBS) et le distribuer dans des fractions égales à tubes de 50 ml conique. (Facultatif:. Répartir dans des tubes coniques supplémentaires pour améliorer le lavage) Centrifuger à 1000 rpm, 4 ° C pendant 5 min.
3. Rejeter le surnageant et les boulettes de détacher doucement en secouant manuel.

6. La purification sur gradient de Ficoll

1. Reprendre le culot avec Ficoll médias à une densité de 1,125 g / ml, pH 7,4 et lentement superposition aliquotes de 10 ml de Ficoll des médias avec des densités de 1,080, 1,060 et 1,037 g / ml.
2. Centrifuger les gradients de Ficoll à 2400 rpm, 4 ° C pendant 20 min.

7. Collection Islet et de la Culture

1. Après centrifugation, les composants des tissus différents peuvent être distingués par leur cloisonnement dans le dégradé.
2. Jeter la couche supérieure constituée de tissus adipeux et conjonctifs.
3. Soigneusement la récolte de la première couche de granulats à l'îlot de 1,037 à 1,060 g / ml d'interphase. Cette couche contient les îlots les plus purs isolés. Recueillir les fractions séparément pour l'isolement efficace.
4. Recueillir le second, la fraction moins pur des agrégats à l'îlot de 1,060 à 1,080 g / ml d'interphase.
5. Diluer le gradient de Ficoll en ajoutant des médias de lavage (900 ml de RPMI 1640 avec 5,5 mM de glucose et 10% de FBS) à chaque tube conique jusqu'à un volume total de 50 ml. Centrifuger à 1000 rpm, 4 ° C pendant 5 min.
6. Jeter le surnageant par aspiration. Faites attention que le culot soit lâche due au gradient de Ficoll.
7. Lavez le wi granulése laver les médias (900ml RPMI 1640 avec 5,5 mM de glucose et 10% de FBS) et centrifuger à 1000 rpm, 4 ° C pendant 5 min. Répétez l'aide de milieux de culture des îlots
8. Resuspendre les îlots de milieux de culture et de les placer dans l'incubateur avec 5% de CO ₂ à 37 ° C pendant 24-48 heures avant traitement ultérieur.

Résultats

Notre protocole a produit une moyenne d'environ 500 îlots par gramme de tissu pancréatique, bien que ce qui a beaucoup varié entre les préparations en raison principalement de différences dans la fibrose et l'activité de la collagénase. Nous avons atteint une pureté> 90% des îlots par coloration d'abord avec la dithizone lors du traitement des tissus, puis triées à la main les 24 heures après l'isolement. Pour déterminer la qualité des îlots purifiés, nous avons testé pour 25 mM de glucose stimulée par la sécrétion d'insuline dans des conditions statiques pendant 2 heures. Nous avons trouvé la sécrétion d'insuline comparable à celle obtenue à partir des îlots ECIT îlot isolement et centres de transplantation. Comme des îlots isolés de pancréas partiellement pancréatectomisés sont pas destinés à la transplantation d'îlots, l'évaluation de l'IEQ totale n'a pas été considérée comme un facteur critique.

Surtout, notre méthode nous a permis d'isoler les îlots pour des études fonctionnelles à partir de 25 patients pancréatectomisés partielle entre 2005 et 2008 ^5. Ces îlots ont été analysés pour le glucose stimulée par la sécrétion d'insuline et de l'expression des protéines spécifiques par Western blot et immunohistochimie. Les îlots isolés partiellement pancreatecomized pancréas peut aussi être utilisé pour comparer les gènes et les profils d'expression de protéines, de l'apparence ultrastructurale et réponses fonctionnelles des îlots non-diabétiques et diabétiques. Parce qu'il ya plus de patients subissant une pancréatectomie partielle qu'il ya de donneurs d'organes, notre protocole pourrait permettre suffisamment d'échantillons et de données à recueillir pour l'analyse statistique robuste.

Discussion

En utilisant notre protocole, îlots humains peut être isolé du tissu pancréatique recueilli à partir d'un pancréatectomie partielle. Le succès de ce protocole repose sur le soin apporté à quelques points essentiels. Pour préserver la viabilité des cellules bêta, il est essentiel que l'échantillon soit transporté rapidement sur la glace au laboratoire. En outre, la durée de la digestion des tissus doivent être optimisés de façon empirique en fonction de la teneur de la fibrose des tissus et l'activité enzymatique de la presse. Cela est également vrai pour le degré de force mécanique appliquée manuellement à la chambre de Ricordi. Ainsi pour obtenir un rendement îlot bonne, le protocole est mieux effectuée par un scientifique dédié ou d'un assistant technique. La rupture initiale est la norme à moins que l'équipe est déjà connu dans l'isolement d'îlots.

Il ya des différences fondamentales entre notre protocole d'isolement des îlots et la méthode standard isolement d'îlots humains: 1) Bien que nous utilisons des tissus pancréatiques soumis à plusieurs heures d'ischémie pendant l'intervention chirurgicale, il est immédiatement transformé sur place. Ceci est en contraste avec pancréas explanté de mort cérébrale donateurs pour le pancréas / transplantation d'îlots, qui restent ischémique pendant plusieurs heures lors de l'attribution et la livraison au centre d'isolement des îlots. 2) Nous injectons collagénase directement dans le tissu pancréatique, tandis que le protocole standard est pour lui insuffler dans le canal pancréatique. 3) Nous nous séparons les îlots en utilisant un gradient de Ficoll discontinu au lieu de recueillir les îlots à partir d'un gradient de Ficoll continu en utilisant un processeur cellulaire COBE.

Dans les cas où le prélèvement chirurgical est trop fibreux ou rares pour isoler un nombre suffisant d'îlots, les tissus peuvent encore être récupérées par microdissection par capture laser (LCM) ^10. Cela permet à des données d'expression génique à être récupéré à partir de pratiquement tous les spécimens, même si l'isolement des îlots échoue ou si le rendement est très faible. Malheureusement, LCM ne produisent pas de cellules vivantes pour des études fonctionnelles et leur montant est généralement insuffisante pour l'analyse protéomique. Ainsi, en utilisant LCM en parallèle avec notre protocole digestion par la collagénase pour récupérer les îlots peut être le moyen le plus efficace pour traiter les prélèvements chirurgicaux.

Lors de la collecte des tissus pour l'isolement des îlots de pancréatectomies partielle, il est important d'examiner attentivement l'histoire clinique du patient et l'état métabolique. Un patient partiellement pancréatectomisés pourrait être affectée par le type 3c diabète, le diabète secondaire à-dire le désordre du pancréas conduisant à une chirurgie ^6. Parmi les 43 patients participant ayant subi cette chirurgie dans notre département en 2010, 32 étaient des non-diabétiques, 5 ont été affectés par le diabète de type 2 et 6 avaient de type 3c diabète. Ces données concordent avec les études précédentes pointant vers métabolisme du glucose et du diabète dans une fraction non négligeable de patients souffrant de cancer du pancréas ou pancréatite chronique ^6. Nous avons considéré le diabète comme étant d'origine primaire si elle a été diagnostiqué au moins un an avant l'apparition des symptômes conduisant à ⁷ chirurgie pancréatique. Les niveaux d'anticorps dirigés contre des autoantigènes îlot devraient également être mesurés pour évaluer une origine auto-immune potentielle du diabète ^8. Parce qu'un patient subissant une pancréatectomie pourrait souffrir d'un diabète non diagnostiqué ou d'être intolérants au glucose, tous les patients non diabétiques doivent être soumis à un test oral de tolérance au glucose avant la pancréatectomie ^9.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Société	Numéro de catalogue
Équipement
1 ml pipette sérologique (CELLSTAR)	Greiner Bio-One	604181
10 ml pipette sérologique (CELLSTAR)	Greiner Bio-One	607180
25 ml pipette sérologique (CELLSTAR)	Greiner Bio-One	760180
Seringue de 10 ml	BD (Becton, Dickinson and Company)	300912
50 ml Seringue	BD (Becton, Dickinson and Company)	300865
Seringue 5 ml	BD (Becton, Dickinson and Company)	309050
18 G 1,1 / 2 aiguilles Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	304622
27 GX1 / 2 aiguilles	Braun	4658300
27 GX3 / 4 Microlance aiguille 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	302200
3 cm de culture cellulaire plat grille 2x2 mm	Nunc	174926
20 cm boîte de culture de tissus	BD (Becton, Dickinson and Company)	353003
6 cm Prise en main facile boîte de Pétri	BD (Becton, Dickinson and Company)	351016
150 ml bouteille de stockage	Corning Incorporated	431175
250 ml Erlenmeyer	Schott Duran	21 217 36
500 ml Erlenmeyer	Schott Duran	21 217 44
250 ml Visser le capuchon du tube conique Bas Centrifugeuse	Corning Incorporated	430776
Falcon de 50 ml conique du tube	BD (Becton, Dickinson and Company)	352070
260 ml Easyflask non-traitées	Nunc	156800
Filtre Millex GV Unité Duropore (0,22 um)	Millipore	SLGV033RB
Bouteille vide Top filtre (PSE 70 mm de diamètre Membran, 0,22 um de taille des pores, la taille du cou 45 mm, 500 ml de volume)	Corning Incorporated	431118
Densitomètre (Densito 30PX) LWE37463	Mettler Toledo	51324450
Rapide PES Unité filtre 0,2 um	Nalgene	569-0020
Batterie de chauffage	Technologies Inc BioRep	HC-02
Multifuge 4 KS-R	Heraeus	75015680
Pompe Typ PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordi chambre (treillis métallique de 600 um de diamètre de pore)	Technologies Inc BioRep	Modèle 50-U-01, 0503-001 série
Préparation stand	Technologies Inc BioRep	50-PS-01
O-Rings	Technologies Inc BioRep	OU-50-U-01
Marbles nitrure de silicium (15 mm de jeu 9)	Technologies Inc BioRep	SN-01
Tubes Silicon	Tygon	R 3603 8,0 X4, 0 mm
Pinces chirurgicales	Braun	BD168R
Ciseaux chirurgicaux (Aesculap)	Braun	BC273R
Bain-marie MCO 200	Grant	MCO 200
Réactifs
Collagénase - RI Libérase> (100 mg)	Roche	11815032001
D (+)-Glucose	Merck	1.08337.1000
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Merck	1.16743.1000
Diphénylthiocarbazone (DTZ)	Sigma-Aldrich	D5130
DNase I (100 mg)	Roche	10104159001
Dulbeccos 1xPBS	Laboratoires AAP	H15-002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00509
Sérum fœtal bovin (FBS)	Laboratoires AAP	A15-101
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Fœtale sérum bovin (FBS)	Gibco	10270-106
2 - (4 - (2-hydroxyéthyl) - 1-pipérazinyl)-ethansulfons ‰ Ure (HEPES)	Roth	9105.3
NaOH 5 M	pharmacie clinique, hôpital	-
Pénicilline / streptomycine (100x)	Laboratoires AAP	P11-010
Pipettaid (EXPRESS)	BD (Becton, Dickinson and Company)	357591
Potassiumchlorid	Fluka	60132
Potassiumdihydrogenphospate anhydre	JT Baker	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JT Baker	3246-01
Milieu RPMI 1640 [-] D-glucose [+] L-Glutamine	Gibco	11879-020
Milieu RPMI 1640 [+] L-Glutamine	Laboratoires AAP	E15-840
Sodiumhydrogencarbonat	Merck	1.06329.0500