Kısmen Pancreatectomized hastalar İnsan Islets izolasyonu

Özet

Araştırma için tip 2 diyabetik adacık kaynağı yetersiz. Burada kısmi pankreatektomi geçiren hastalardan izole adacıklar için protokol paylaşın. Bu yaklaşım, tip 2 diyabetik adacıklar elde etmek için eşsiz bir mekan temsil eder ve temel ve klinik çalışmalar için yeterli sayıda non-diyabetik hastalarda klinik olarak uyumlu.

Özet

, Tip 2 diyabet ve Langerhans ^arıza 1 adacık patogenezinde soruşturmalar organ ^bağışına 2 tip 2 diyabetik adacıklar sınırlı sayıda engel var . Burada adacıklar tip 2 diyabetik ve non-diyabetik hastalarda farklı pankreas hastalıkları (iyi veya kötü huylu pankreas tümörleri, kronik pankreatit ve koledok veya duodenal tümörlerin) nedeniyle kısmi pankreatektomi geçirmiş elde İnsan pankreas dokusundan izole etmek için protokol paylaşmak . Katılan tüm hastalara aynı zamanda yerel etik komitesi tarafından onaylanmış olan bu çalışma, onların rızasını verdi. Cerrahi örneklerin hemen tanısal amaçlı hasarlı doku istinat yumuşak ve sağlıklı görünmesini pankreatik doku, adacık izolasyonu için seçilen patolog teslim edildi. 1.000 'den fazla adacıkları izole için, pankreas dokusunun en az 2 g ile başlamak zorundaydık. Ayrıca bizim protokol gerekli enzim içeren medya enjekte gözle görülür bir doku gerilmek ve daha sonra yüzey alanını artırarak sindirime yardımcı olmak için kıyma oldu.

İnsan pankreas dokusu büyük miktarda (> 15g) kullanılabilir olduğu zaman zaman durum dahil etmek için protokol uygulanabilirliği genişletmek için, doku sindirmek için bir Ricordi odası (50 ml). Sindirim sırasında, elle numune ile doku fibrozis seviyesine göre değişen bir yoğunlukta Ricordi kamara ³ salladı. Bir süreksiz Ficoll degrade sonra asiner doku adacıkları ayırmak için kullanılır oldu. Biz doku pelet kadar küçük homojen Ficoll ortamda 1.125 g / ml 'lik bir yoğunluk ile yeniden süspanse olması gerektiğini kaydetti. Izolasyondan sonra, biz onların fonksiyonel iyileşmeyi kolaylaştırmak için en az 48 saat süreyle% 5 CO ₂ ile 37 ° stressiz koşulları (hiçbir sallayarak veya rotasyon) ° C altında adacıklar kültür. Protokol ve gelecekteki gelişme yaygın uygulama, tip 2 diyabet araştırma büyük ölçüde ilerleyen, diyabetik insan adacık büyük miktarlarda zamanında hasat ve non-diyabetik hastalarda klinik olarak uyumlu sağlayabilir.

Protokol

1. Pankreas doku toplama ameliyathanede

1. Cerrah, pankreas kısmi rezeksiyon gerçekleştirir.
2. Patolog, buz üzerinde bir kutu içinde pankreas örnek yerleştirdikten sonra, hemen teslim.

2. Adacık izolasyonu için doku seçimi

1. Patolog tanısal amaçlı hasarlı dokuyu koruyarak, yumuşak ve sağlıklı görünen doku seçer. Fibrotik doku ve kullanılabilir dokusunun az 2 g sunan örneklerinden adacık izolasyon dışındadır.
2. Euro Collins Çözüm pankreas dokusu daldırın ve laboratuvara buz üzerinde teslim.

3. Insan adacık izolasyonu

1. Pankreas dokusu tartılır, daha sonra 10 cm çanak içine yerleştirin.
2. 500 ml cam şişe içinde 150 ml RPMI medya koyun.
3. 250 ml cam şişe içinde, 100 mg / ml DNaz ve 5mg/ml Liberase RI 20 ml, 130 ml RPMI medya birleştirerek sindirim enzimi solüsyon hazırlanır. Bu çözümün pankreas dokusu enjekte etmek için bir şırınga içine 10 ml çizin.
4. Homojen bu gerilmek amaçlayan sindirim enzimi çözümü, pankreas dokusu içine enjekte edilir. Fibrozis önlenir, sindirim muhtemelen başarısız olacaktır. Daha sonra, yaklaşık 4 mm içine buz üzerinde ³ adet doku kıyma.

4. İnsan pankreas sindirim devre

1. Şekil 1'de gösterildiği gibi sindirim devre birleştirin. Ricordi odasında odasının üst kısmında alt ve dışarı akış yönü.
2. Toplam hacmi 300 ml, 500 ml balona kalan sindirim enzim çözeltisi ekleyin ve bir termometre yerleştirin.
3. Odasına, pankreas dokusu transfer örgü (gözenek çapı: 600 mikron) yerleştirin ve üç Silikon Nitrür Mermerler (çap: 15 mm), oda kapatın ve 140 ml / dk akış ile pompa start.
4. Devre sıcaklığı 37 ulaştığında ° C, zamanlama başlangıç ​​ve periyodik olarak sindirim durdurmak için ne zaman belirlemek için numune almak. Dithizone (2 mg / ml) ile boyanarak sindirilir doku ⁴ içinde adacıklar mikroskopik görüntüleme sağlar.
5. Asiner doku çevresindeki adacıklar ayrılır sonra, buz üzerinde yerleştirerek ve ısıtma rezistansı devre soğuk yıkama medya 200 ml (900 ml RPMI 1640 5.5 mM glukoz ve% 10 FBS) ekleyerek sindirim hemen durdurmak.
6. 250 ml konik tüpler adacık çözüm örnek tüp çıkıyor toplayın. Devre boşalana kadar devam edin.

Şekil 1. Ve üç silisyum nitrür mermerler (çap: 15 mm): insan pankreas sindirim devresi insan pankreas sindirim devre örgü (600 mikron gözenek çapı) içeren bir Ricordi odasına içerir. Odasından Çıkış peristaltik pompa (140 ml / dk) doku toplama şişesi sürülür. Oklar, akış yönünü gösterir. Enzimatik sindirim için en uygun sıcaklık 37 ° C su banyosunda ısıtma rezistansı çeker tarafından yapılmaktadır.

5. Çamaşır-sindirim sonrası

1. 5 dakika süreyle 1000 rpm'de adacık çözümü, 4 ° C içeren 250 ml konik tüpler santrifüjleyin.
2. Süpernatantı atın, (5.5 mM glukoz ve% 10 FBS ile 900 ml RPMI 1640) yıkama medya adacık pelet tekrar süspansiyon ve 50 ml konik tüpler eşit kesirler dağıtmak. (Opsiyonel: yıkama artırmak için ek konik tüpler içine dağıtın) 1000 rpm'de Santrifüj, 4 ° C 5 dk.
3. Supernatant atın ve yavaşça el sallayarak pelet gevşetin.

6. Ficoll degrade saflaştırılması

1. Yoğunluğu 1.125 g / ml, pH 7.4 Ficoll medya ile pelletini tekrar ve yavaş yavaş 1.080, 1.060 ve 1.037 g / ml yoğunlukları ile 10 ml alikotları Ficoll medya kaplaması.
2. 20 dakika için 4 ° C, 2400 rpm Ficoll gradyanlar santrifüjleyin.

7. Islet Toplama ve Kültür

1. Santrifüj sonra, farklı doku bileşenleri degrade bölümleme tarafından ayırt edilmelidir.
2. Yağ ve bağ dokusu oluşan üst tabaka atın.
3. 1,037-1,060 g / ml interfaz adacık agregaların ilk katman dikkatlice hasat. Bu tabaka, en saf izole adacıklar içerir. Kesirler verimli izolasyon için ayrı ayrı toplayın.
4. 1,060-1,080 g / ml interfaz adacık agrega, ikincisi daha az saf fraksiyon toplayın.
5. 50 ml toplam hacmi her konik tüp (5.5 mM glukoz ve% 10 FBS ile 900 ml RPMI 1640) yıkama medya ekleyerek Ficoll degrade sulandırınız. 1000 rpm'de santrifüj, 4 ° C 5 dk.
6. Emme ile süpernatantı atın. Pelet Ficoll degrade gevşek bağlı olabileceği gibi dikkatli kullanın.
7. Pelet yıkayın with yıkama medya (5.5 mM glukoz ve% 10 FBS 900ml RPMI 1640) ve 1000 rpm az santrifüj, 4 ° C de 5 dakika. Adacık kültür ortamı kullanarak tekrarlayın.
8. Kültür ortamı içinde adacıklar süspanse edin ve% 5 CO ₂ ile 37 kuvöz koyun ° C daha fazla işlem 24-48 saat önce için.

Sonuçlar

Bu büyük ölçüde fibrozis ve kollajenaz aktivitesi büyük ölçüde farklılıklar nedeniyle hazırlıklar arasında değişmektedir rağmen protokol, pankreas dokusu gram başına ~ 500 adacık ortalama vermiştir. Daha sonra 24 saat sonra izolasyon Ayıklama, doku işleme sırasında Dithizone ilk boyama ile>% 90 adacık saflık elde etti. Arındırılmış adacıklar kalitesini belirlemek için, 25 mM glukoz ile uyarılmış insülin salgılanması için 2 saat boyunca durağan koşullar altında test edilmiştir. Biz ECIT adacık izolasyonu ve organ nakli merkezleri elde adacık insülin salgılanması Benzer bulundu. Olarak kısmen pancreatectomized pancreata izole adacıklar adacık nakli, kritik bir faktör olarak kabul edilmez toplam iEQ değerlendirilmesi anlamına gelmez.

Önemlisi, yöntem bize, 2005 ve ²⁰⁰⁸ 5 arasında 25 kısmi pancreatectomized hastalarda fonksiyonel çalışmalar için adacıkları izole etmek için etkin . Bu adacıklar batı blot ve immünohistokimya glukoz ile uyarılmış insülin salgılanması ve özel protein ekspresyonu analiz edilmiştir. Kısmen pancreatecomized pancreata izole adacıklar da gen ve protein ekspresyon profilleri, ultrastrüktürel görünüm ve non-diyabetik ve diyabetik adacıklar fonksiyonel yanıtları karşılaştırmak için kullanılan olabilir. Daha fazla hasta organ bağışına daha kısmi pankreatektomi geçiren olduğundan, protokol yeterince örnekler ve veriler sağlam bir istatistiksel analiz için toplanan izin verebilir.

Tartışmalar

Bizim protokolünü kullanarak, insan adacıklar kısmi pankreatektomi alınan pankreas dokusundan izole edilebilir. Bu protokolün başarı birkaç kritik noktaları sırasında alınan bakım dayanır. Beta-hücre canlılığını korumak için, numune laboratuvara buz üzerinde hızla taşınması olması esastır. Ayrıca, doku sindirim süresi, doku fibrozis ve medya enzimatik aktivite derecesine göre ampirik olarak optimize edilmiş olmalıdır. Bu Ricordi odasına elle uygulanan mekanik kuvvet derecesi için de geçerlidir. Böylece iyi bir adacık verimi elde etmek için, protokol en iyi özel bir bilim adamı ya da teknik yardımcısı tarafından yapılır. Takım zaten adacık izolasyonu yaşanan sürece İlk başarısızlık norm.

Adacık izolasyon protokolü ve standart insan adacık izolasyon yöntemi arasında önemli farklılıklar vardır: 1) cerrahi işlem sırasında birkaç saat iskemi maruz pankreas dokusu kullanmasına rağmen, hemen sitesinde işlenir. Bu tahsisi ve adacık izolasyonu tesisi teslim sırasında birkaç saat için iskemik kalan pankreas / adacık nakli için beyin-ölü donörler, eksplante pancreata aksine. Standart bir protokol pankreatik kanal içine demlenmeye 2) ise, doğrudan pankreas dokusu içine enjekte kollajenaz. 3) Biz COBE hücre işlemci kullanarak sürekli bir Ficoll degrade adacıklar toplama yerine süreksiz Ficoll degrade kullanarak adacıklar ayırın.

Cerrahi numune çok fibrotik veya yeterli sayıda adacık izole etmek için kıt olduğu durumlarda, doku hala lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) ¹⁰ tarafından alınacak. Bu gen ekspresyonu verileri adacık izolasyon başarısız ya da verim çok düşük olsa bile, hemen hemen her numune tahsil edilecek sağlar. Ne yazık ki, LCM fonksiyonel çalışmalar için canlı hücreler üretmek değildir ve bunların tutarı proteomik analiz için genellikle yetersiz kalmaktadır. Böylece, adacıklar almak için kollajenaz sindirim protokolü ile paralel olarak LCM kullanarak cerrahi örnekleri işlemek için en etkili yolu olabilir.

Kısmi pancreatectomies adacık izolasyonu için doku toplarken, hastanın klinik öykü ve metabolik durumunu dikkatle incelemek için önemlidir. Kısmen pancreatectomized bir hasta tip 3c diyabet yani şeker hastalığı, ^cerrahi 6 yol açan pankreas bozukluğu ikincil tarafından etkilenmiş olabilir . Kliniğimizde 2010 yılında bu ameliyat geçiren 43 katılan hastalar arasında, 32 non-diyabetik, 5 tip 2 diyabet ve 6 etkilendi tipi 3c diyabet vardı. Bu veriler, daha önceki çalışmaları ile bozulmuş glikoz metabolizması ve diyabet pankreas kanser veya kronik pankreatit ⁶ muzdarip hastaların büyük bir kısmını işaret kabul etmiş sayılırsınız. Biz birincil kökenli ⁷ pankreas ameliyatı olan semptomların başlangıcından önce en az bir yıl tanısı kondu diyabet olarak kabul edilecek. Adacık otoantijenler karşı antikor düzeyleri de potansiyel bir diyabet ⁸ otoimmün kökenli değerlendirmek için ölçülmelidir. Pankreatektomi geçiren bir hastanın, tanı konmamış diyabet muzdarip veya glukoz hoşgörüsüz olabileceğinden, tüm non-diyabetik hastalarda oral glukoz tolerans testi ^önce 9 pankreatektomi verilmelidir .

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Şirket	Katalog numarası
Ekipman
1 ml Serolojik pipet (CELLSTAR)	greiner biyo-bir	604181
10 ml Serolojik pipet (CELLSTAR)	greiner biyo-bir	607180
25 ml Serolojik pipet (CELLSTAR)	greiner biyo-bir	760180
10 ml Şırınga	BD (Becton Dickinson ve Şirket)	300912
50 ml Şırınga	BD (Becton Dickinson ve Şirket)	300865
5 ml Şırınga	BD (Becton Dickinson ve Şirket)	309050
18 G 1,1 / 2 İğne Microlance 3	BD (Becton Dickinson ve Şirket)	304622
27 GX1 / 2 İğne	Braun	4658300
27 GX3 / 4 İğne Microlance 3	BD (Becton Dickinson ve Şirket)	302200
3 cm hücre kültürü çanak 2x2 mm ızgara	Nunc	174926
20 cm Doku kültürü çanak	BD (Becton Dickinson ve Şirket)	353003
6 cm Kolay tutuş petri	BD (Becton Dickinson ve Şirket)	351016
150 ml şişe depolama	Corning Incorporated	431175
250 ml'lik şişeler Erlenmeyer	Schott Duran	21 217 36
500 ml'lik şişeler Erlenmeyer	Schott Duran	21 217 44
250 ml Vidalı Kapak Konik Alt Santrifüj Tüpü	Corning Incorporated	430776
50 ml Falcon konik tüp	BD (Becton Dickinson ve Şirket)	352070
260 ml Easyflask Sigara tedavi	Nunc	156800
Millex GV Filtre Ünitesi Duropore (0,22 mm)	Millipore	SLGV033RB
Filtre Şişe En Vakum (PES 70 mm Çap Membran, 0,22 mikron gözenek boyutu, 45 mm boyun boyutu, 500 ml hacim)	Corning Incorporated	431118
Dansitometre (Densito 30px) LWE37463	Mettler Toledo	51324450
Hızlı PES Filtre Ünitesi 0,2 mikron	Nalgene	569-0020
Isıtma Bataryası	BioRep Technologies Inc	HC-02
Multifuge 4 KS-R	Heraeus	75015680
Hidrolik Typ PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordi kamara (600 mikron gözenek çapı metal örgü)	BioRep Technologies Inc.	Model 50-U-01, Seri 0503-001
Hazırlık Standı	BioRep Technologies Inc.	50-PS-01
O-Ringler	BioRep Technologies Inc.	YA-50-U-01
Silikon Nitrür Mermerler (15 mm set 9)	BioRep Technologies Inc.	SN-01
Silikon Boru	Tygon	R 3603 8,0 X4, 0 mm
Cerrahi forseps	Braun	BD168R
Cerrahi makaslar (Aesculap)	Braun	BC273R
Su banyosu, 200 EKK	Hibe	EKK 200
Reaktifler
Kollajenaz -> Liberase RI (100 mg)	Roche	11815032001
D-Glukoz (+)	Merck	1.08337.1000
Dimethylsülfoksit (DMSO)	Merck	1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone (DTZ)	Sigma Aldrich	D5130
DNaz I (100 mg)	Roche	10104159001
Dulbeccos 1xPBS	PAA Laboratuvarları	H15-002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00509
Fetal sığır serumu (FBS)	PAA Laboratuvarları	A15-101
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F9378
Fetal Sığır serum (FBS)	Gibco	10270-106
2 - (4 - (2-hidroksietil) - 1-piperazinyl) ethansulfons ‰ ure (Hepes)	Roth	9105,3
5 M NaOH	klinik eczane, hastane	-
Penisilin / Streptomisin (100x)	PAA Laboratuvarları	P11-010
Pipettaid (AÇIK)	BD (Becton Dickinson ve Şirket)	357591
Potassiumchlorid	Fluka	60132
Potassiumdihydrogenphospate susuz	JT Baker	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JT Baker	3246-01
RPMI Orta 1640 [-] D-Glukoz [+] L-Glutamine	Gibco	11879-020
RPMI Orta 1640 [+] L-Glutamine	PAA Laboratuvarları	E15-840
Sodiumhydrogencarbonat	Merck	1.06329.0500