Isolamento de Ilhotas Humanos de pacientes parcialmente pancreatectomizado

Resumo

O fornecimento de diabéticos tipo 2 ilhotas para pesquisa é insuficiente. Aqui nós compartilhamos nosso protocolo para isolar ilhotas de pacientes submetidos à pancreatectomia parcial. Esta abordagem representa um local único para a obtenção de ilhotas de diabéticos tipo 2 e clinicamente combinado não-diabéticos em número adequado para estudos básicos e clínicos.

Resumo

Investigações sobre a patogênese da diabetes tipo 2 e ilhotas de Langerhans ^um mau funcionamento tem sido prejudicada pela disponibilidade limitada de ilhotas diabéticos tipo 2 de ² doadores de órgãos. Aqui nós compartilhamos nosso protocolo para isolar ilhotas pancreáticas humanas a partir de tecido obtido a partir de diabéticos tipo 2 e não diabéticos que foram submetidos a pancreatectomia parcial devido a doenças pancreáticas diferentes (tumores pancreáticos benignos ou malignos, pancreatite crônica, e ducto biliar comum ou tumores duodenal) . Todos os pacientes envolvidos deram o seu consentimento a este estudo, que também havia sido aprovado pelo Comitê de Ética local. Os espécimes cirúrgicos foram imediatamente entregues ao patologista que selecionou tecido pancreático macia e saudável aparecendo para o isolamento de ilhotas, mantendo o tecido danificado para fins de diagnóstico. Descobrimos que para isolar mais de 1.000 ilhotas, tivemos que começar com pelo menos 2 g de tecido pancreático. Também essencial para o nosso protocolo foi visivelmente a distender o tecido ao injetar a mídia contendo enzima e, posteriormente, mediu-lo para ajudar a digestão, aumentando a área de superfície.

Alargar a aplicabilidade do nosso protocolo para incluir o caso ocasional em que uma grande quantidade (> 15g) de tecido pancreático humano está disponível, foi utilizado uma câmara de Ricordi (50 ml) para digerir o tecido. Durante a digestão, que balançou a câmara manualmente Ricordi ³ em uma intensidade que variou de amostra de acordo com seu nível de fibrose tecidual. A descontínua gradiente Ficoll foi então usada para separar as ilhotas do tecido acinar. Notamos que o tecido pellet deve ser pequeno o suficiente para ser homogeneamente ressuspenso em meio Ficoll com uma densidade de 1,125 g / ml. Após o isolamento, as ilhotas cultivadas que sob condições de estresse livre (sem agitação ou rotação) com 5% de CO ₂ a 37 ° C durante pelo menos 48 h, a fim de facilitar a sua recuperação funcional. Aplicação generalizada do nosso protocolo e seu aperfeiçoamento futuro poderia permitir a colheita oportuna de grandes quantidades de ilhotas humanas de diabéticos e clinicamente combinado não-diabéticos, com grande avanço da diabetes tipo de pesquisa 2.

Protocolo

1. Coleta de tecido pancreático na sala de cirurgia

1. O cirurgião realiza uma ressecção parcial do pâncreas.
2. Depois de colocar a amostra de pâncreas em uma caixa de gelo, entregá-lo imediatamente para o patologista.

2. Seleção de tecidos para isolamento de ilhotas

1. O patologista seleciona tecido que parece macia e saudável, mantendo o tecido danificado para fins de diagnóstico. Tecido fibrótico e espécimes oferecendo menos de 2 g de tecido utilizável são excluídos do isolamento de ilhotas.
2. Mergulhe o tecido pancreático em solução Euro Collins e entregar no gelo para o laboratório.

3. Isolamento de ilhotas humanas

1. Pese o tecido pancreático, em seguida, coloque-o em um prato de 10 cm.
2. Coloque 150 ml RPMI mídia em um balão de 500 ml.
3. Em um frasco de 250 ml, preparar a solução de enzimas digestivas, combinando RPMI 130 ml de mídia com 100 mg / ml DNase e 20 ml de 5mg/ml RI Liberase. Draw 10 ml desta solução para uma seringa para injetar o tecido pancreático.
4. Injetar a solução de enzimas digestivas no tecido pancreático, com o objetivo de distender-lo de forma homogênea. Se este for impedido pela fibrose, a digestão, provavelmente, falhar. Em seguida, mediu o tecido em ~ 4 mm ³ peças no gelo.

4. Circuito digestão humana pâncreas

1. Monte o circuito da digestão, como mostrado na Figura 1. O sentido do fluxo na câmara Ricordi é no fundo e sair no topo da câmara.
2. Adicionar a solução de enzima digestiva restantes para o balão de 500 ml até um volume total de 300 ml e coloque um termômetro.
3. Transferir o tecido pancreático para a câmara, insira o mesh (diâmetro dos poros: 600 mm) e três Marbles nitreto de silício (diâmetro: 15 mm), perto da câmara e começar a bomba com o fluxo fixado em 140 ml / min.
4. Quando a temperatura do circuito atinge 37 ° C, iniciar a cronometragem e, periodicamente, colher amostras para determinar quando parar a digestão. Coloração com ditizona (2 mg / ml) permite a visualização microscópica de ilhotas no tecido digerido ^4.
5. Uma vez que os ilhéus são separados a partir do tecido acinar circundante, rapidamente parar a digestão, colocando a bobina de aquecimento no gelo e adicionando 200 ml de mídia lavagem a frio (900 ml RPMI 1640 com 5,5 mM de glicose e FBS 10%) para o circuito.
6. Recolher a solução de ilhotas em 250 ml tubos cônicos, uma vez que sai do tubo de amostra. Continue até que o circuito está vazio.

Figura 1. O circuito de digestão humana pâncreas O circuito digestão humana pâncreas inclui uma câmara de Ricordi contendo mesh (diâmetro dos poros: 600 mm) e três bolas de gude nitreto de silício (diâmetro: 15 mm). Saída da câmara é movida para o balão de coleta de tecido pela bomba peristáltica (140 ml / min). Setas indicam a direção do fluxo. Uma temperatura ideal para a digestão enzimática é mantida por imersão da bobina de aquecimento em banho-maria a 37 ° C.

5. Lavagem pós-digestão

1. Centrifugar a 250 ml tubos cônicos contendo a solução de ilhotas a 1000 rpm, 4 ° C por 5 min.
2. Desprezar o sobrenadante, ressuspender o sedimento ilhota na lavagem de mídia (900 ml RPMI 1640 com 5,5 mM de glicose e FBS 10%) e distribuí-lo em frações iguais a 50 tubos de ml. (Opcional:. Distribuir em tubos cônicos adicionais para melhorar a lavagem) Centrifugar a 1000 rpm, 4 ° C por 5 min.
3. Elimine o sobrenadante e gentilmente afrouxar pellets por agitação manual.

6. Purificação em um gradiente de Ficoll

1. Ressuspender o sedimento com Ficoll media a uma densidade de 1,125 g / ml, pH 7,4 e lentamente overlay alíquotas de 10 ml de Ficoll media com densidades de 1,080, 1,060 e 1,037 g / ml.
2. Centrifugar os gradientes de Ficoll a 2400 rpm, 4 ° C por 20 min.

7. Islet Recolha e Cultura

1. Após a centrifugação, componentes do tecido diferentes podem ser distinguidos pela sua partição no gradiente.
2. Descartar a camada superior composta de gordura e tecido conjuntivo.
3. Cuidadosamente a colheita da primeira camada de agregados ilhota na interfase 1,037-1,060 g / ml. Esta camada contém as ilhotas mais puro isolado. Coletar fracções para isolamento eficiente.
4. Recolher a fracção de segundo, menos pura de agregados ilhota na interfase 1,060-1,080 g / ml.
5. Diluir o gradiente de Ficoll, adicionando media de lavagem (900 ml RPMI 1640 com 5,5 mM de glicose e FBS 10%) a cada tubo cônico até um volume total de 50 ml. Centrifugar a 1000 rpm, 4 ° C por 5 min.
6. Desprezar o sobrenadante por sucção. Tenha cuidado como o pellet pode estar solto devido ao gradiente de Ficoll.
7. Lave o wi pelletsª lavagem de mídia (900ml RPMI 1640 com 5,5 mM de glicose e FBS 10%) e centrifugar a 1000 rpm, 4 ° C por 5 min. Repita usando meios de cultura ilhéu
8. Volte a suspender as ilhotas em meios de cultura e colocá-los na incubadora com 5% de CO ₂ a 37 ° C por 24-48 horas antes do processamento.

Resultados

Nosso protocolo renderam uma média de ~ 500 ilhotas por grama de tecido pancreático, embora este muito variadas entre as preparações em grande parte devido a diferenças na fibrose e atividade da colagenase. Conseguimos> pureza das ilhotas de 90% através da coloração pela primeira vez com Ditizona durante o processamento de tecidos, então handpicking-los 24 horas depois do isolamento. Para determinar a qualidade das ilhotas purificadas, testamos para 25 mM de glicose estimulada a secreção de insulina em condições estáticas, por 2 horas. Encontramos a secreção de insulina comparável à de ilhotas obtidas de ECIT isolamento de ilhotas e centros de transplantação. Como ilhotas isoladas de pancreata parcialmente pancreatectomizado não são destinadas para transplante de ilhotas, a avaliação da IEQ total foi de que não foi considerada um fator crítico.

Importante, o nosso método nos permitiu isolar ilhotas para estudos funcionais de 25 pacientes parcial pancreatectomizado entre 2005 e 2008 ^5. Estas ilhas foram analisadas para glicose estimulada a secreção de insulina e expressão de proteínas específicas borrando ocidental e imuno-histoquímica. Ilhotas isoladas de pancreata parcialmente pancreatecomized também poderia ser usado para comparar genes e de perfis de proteínas de expressão, aparência ultra-estruturais e respostas funcionais de ilhotas não-diabéticos e diabéticos. Porque há mais pacientes submetidos à pancreatectomia parcial do que há doadores de órgãos, o nosso protocolo poderia permitir que amostras suficientes e dados a serem coletados para análise estatística robusta.

Discussão

Usando nosso protocolo, as ilhotas humanas podem ser isoladas de tecido pancreático coletados a partir de uma pancreatectomia parcial. O sucesso deste protocolo baseia-se no cuidado durante alguns pontos críticos. Para preservar a viabilidade das células beta, é essencial que a amostra seja transportada rapidamente sobre o gelo para o laboratório. Além disso, a duração da digestão do tecido deve ser otimizado empiricamente de acordo com o grau de fibrose tecidual ea atividade enzimática da mídia. Isso também é verdadeiro para o grau de força mecânica aplicada manualmente à câmara Ricordi. Assim, para obter um rendimento bom ilhéu, o protocolo é melhor executada por um cientista dedicado ou assistente técnico. Fracasso inicial é a norma, a menos que a equipe já está experiente em isolamento de ilhotas.

Existem diferenças fundamentais entre o nosso protocolo de isolamento de ilhotas eo método padrão de isolamento de ilhotas humanas: 1) Apesar de usarmos tecido pancreático submetido a várias horas de isquemia durante o procedimento cirúrgico, ele é imediatamente transformado em site. Isto está em contraste com pancreata explantado de doadores em morte encefálica para o pâncreas / transplante de ilhotas, que permanecem isquêmica por várias horas durante a alocação e entrega à instalação de isolamento de ilhotas. 2) Nós colagenase injetar diretamente no tecido pancreático, enquanto que o protocolo padrão é infundir-lo para o ducto pancreático. 3) Nós separar as ilhotas utilizando um gradiente de Ficoll descontínua em vez de recolher as ilhotas de um gradiente de Ficoll contínua usando um processador de células COBE.

Nos casos em que a peça cirúrgica é muito fibrótica ou escassos para isolar um número adequado de ilhotas, o tecido ainda podem ser recuperados por laser microdissecção de captura (LCM) ^10. Isso permite que dados de expressão gênica a ser recuperado a partir de praticamente todas as amostras, mesmo que o isolamento das ilhotas falhar ou o rendimento é muito baixo. Infelizmente, LCM não produz células vivas para estudos funcionais e sua quantidade é normalmente insuficiente para análise proteômica. Assim, usando LCM em paralelo com nosso protocolo de digestão da colagenase para recuperar as ilhotas podem ser a maneira mais eficaz de processo de peças cirúrgicas.

Ao coletar tecidos para isolamento de ilhotas de pancreatectomies parcial, é importante examinar cuidadosamente a história clínica do paciente e estado metabólico. Um paciente parcialmente pancreatectomizado poderiam ser afetados por diabetes tipo 3c, ou seja, diabetes secundário ao distúrbio do pâncreas levando a cirurgia ^6. Entre os 43 pacientes participantes que se submeteram a esta cirurgia em nosso serviço em 2010, 32 eram não-diabéticas, 5 foram afetadas pelo diabetes tipo 2 e 6 apresentavam diabetes tipo 3c. Estes dados concordam com estudos anteriores que apontam para o metabolismo da glicose prejudicada e diabetes em uma fração considerável de pacientes que sofrem de câncer de pâncreas ou pancreatite crônica ^6. Consideramos diabetes ser de origem primária se foi diagnosticado pelo menos um ano antes do início dos sintomas principais da cirurgia pancreática ^7. Os níveis de anticorpos contra ilhotas auto-antígenos também devem ser medidos para avaliar uma origem auto-imune potencial do diabetes ^8. Porque um paciente submetido a pancreatectomia poderia sofrer de diabetes não diagnosticada ou ser intolerantes à glicose, todos os pacientes não-diabéticos deve ser dado um teste de tolerância oral à glicose antes da pancreatectomia ^9.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número de catálogo
Equipamento
1 ml sorológicos pipeta (CELLSTAR)	Greiner Bio-One	604181
10 ml sorológicos pipeta (CELLSTAR)	Greiner Bio-One	607180
25 ml sorológicos pipeta (CELLSTAR)	Greiner Bio-One	760180
Seringa de 10 ml	BD (Becton, Dickinson and Company)	300912
Seringa 50 ml	BD (Becton, Dickinson and Company)	300865
Seringa 5 ml	BD (Becton, Dickinson and Company)	309050
18 Agulha 1,1 G / 2 Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	304622
27 GX1 / 2 Agulha	Braun	4658300
27 GX3 / 4 Microlance Agulha 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	302200
3 centímetros de cultura de células de grade prato milímetros 2x2	Nunc	174926
20 centímetros prato de cultura de tecidos	BD (Becton, Dickinson and Company)	353003
6 centímetros Fácil aderência placa de Petri	BD (Becton, Dickinson and Company)	351016
150 ml garrafa de armazenamento	Corning Incorporated	431175
250 ml Erlenmeyers	Schott Duran	21 217 36
500 ml Erlenmeyers	Schott Duran	21 217 44
250 ml Screw Cap tubo de centrífuga cônico inferior	Corning Incorporated	430776
Falcon 50 ml tubo cônico	BD (Becton, Dickinson and Company)	352070
260 ml Easyflask não-tratados	Nunc	156800
Millex GV Filtro Unidade Duropore (0,22 mm)	Millipore	SLGV033RB
Vacuum Bottle Top Filter (PES 70 milímetros de diâmetro Membran, 0,22 mM tamanho dos poros, tamanho 45 pescoço mm, volume de 500 mL)	Corning Incorporated	431118
Densitômetro (Densito 30px) LWE37463	Mettler Toledo	51324450
Unidade PES rápido Filtro 0,2 mM	Nalgene	569-0020
Bobina de aquecimento	BioRep Technologies Inc	HC-02
Multifuge 4 KS-R	Heraeus	75015680
Bomba Typ PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordi câmara (malha de metal com 600 mM de diâmetro dos poros)	BioRep Technologies Inc.	Modelo 50-U-01, 0503-001 Serial
Fique preparação	BioRep Technologies Inc.	50-PS-01
O-Rings	BioRep Technologies Inc.	OR-50-U-01
Mármores de nitreto de silício (15 set mm de 9)	BioRep Technologies Inc.	SN-01
Tubulação de silicone	Tygon	R 3603 8,0 X4, 0 mm
Pinça cirúrgica	Braun	BD168R
Tesoura cirúrgica (Aesculap)	Braun	BC273R
Banho de água OLS 200	Conceder	OLS 200
Reagentes
Colagenase - RI Liberase> (100 mg)	Roche	11815032001
D (+)-Glicose	Merck	1.08337.1000
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Merck	1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone (DTZ)	Sigma Aldrich	D5130
DNase I (100 mg)	Roche	10104159001
Dulbeccos 1xPBS	PAA Laboratories	H15-002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00509
De soro fetal bovino (FBS)	PAA Laboratories	A15-101
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F9378
Fetal bovino Serum (FBS)	Gibco	10270-106
2 - (4 - (2-hidroxietil) - 1-piperazinil)-ethansulfons ‰ ure (HEPES)	Roth	9105,3
NaOH, 5 M	farmácia clínica, hospital	-
Penicilina estreptomicina / (100x)	PAA Laboratories	P11-010
Pipettaid (EXPRESS)	BD (Becton, Dickinson and Company)	357591
Potassiumchlorid	Fluka	60132
Potassiumdihydrogenphospate anidro	JT Baker	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JT Baker	3246-01
Meio RPMI 1640 [-] D-Glicose [+] L-Glutamina	Gibco	11879-020
Meio RPMI 1640 [+] L-Glutamina	PAA Laboratories	E15-840
Sodiumhydrogencarbonat	Merck	1.06329.0500