从部分Pancreatectomized患者的人类胰岛的分离

摘要

为研究2型糖尿病胰岛供应不足。在这里，我们分享我们的协议隔离部分胰腺切除术病人的胰岛。这种方法代表一个独特的场地和2型糖尿病胰岛获得足够数量的非糖尿病患者的临床基础和临床研究相匹配。

摘要

2型糖尿病胰岛器官捐赠者²有限的2型糖尿病和胰岛故障¹胰岛的发病机理的调查而受到阻碍。在这里，我们分享我们的协议从2型糖尿病患者和非糖尿病患者都发生了不同的胰腺疾病（良性或恶性胰腺肿瘤，慢性胰腺炎，胆总管或十二指肠肿瘤）由于部分胰腺切除术的患者获得的人胰腺癌组织分离的胰岛。所有患者参与了他们的同意，这项研究中，也已经由当地伦理委员会的批准。手术标本被立即传送到选定为胰岛隔离柔软和健康出现胰腺组织，保留用于诊断目的的受损组织的病理学家。我们发现，分离出1000多小岛，我们已开始与胰腺组织至少2克。我们的协议还必须是明显扩张的组织注入含酶的媒体时，随后讳言，以帮助消化，增加表面积。

为了扩展我们的协议的适用性，包括大量人力胰腺组织（> 15G）是在偶然情况下，我们使用了Ricordi腔（50毫升）消化组织。在消化过程中，我们手动摇摇Ricordi ^厅由试样的强度不同，根据其组织纤维化的程度。然后用一个不连续的聚蔗糖梯度从胰腺组织中分离出来的胰岛细胞。我们注意到，组织沉淀应足够小，密度为1.125克/毫升被均匀悬浮聚蔗糖培养基。隔离后，我们培养了至少48小时的小岛，以促进其功能恢复，下无应力条件下（无需摇动或旋转_）5％的CO 2在37 ° C。我们的协议和今后改进的广泛应用，可以使大量从人类糖尿病胰岛适时采收和临床相匹配的非糖尿病患者，极大地推进了2型糖尿病的研究。

研究方案

1。胰腺组织收集在手术室

1. 外科医生执行的胰腺部分切除。
2. 胰腺标本放置在一个盒子上冰后，立即送到病理学家。

2。胰岛隔离的组织选择

1. 病理学家选择柔软，健康的组织出现，保留用于诊断目的的受损组织。提供不少于2克可用组织的纤维组织和标本排除胰岛隔离。
2. 沉浸在欧元Collins液的胰腺组织和实验室提供的冰。

3。人类胰岛的分离

1. 称取胰腺组织，然后放入一个10厘米的菜。
2. 在500毫升容量瓶中放入150毫升的RPMI媒体。
3. 在250毫升容量瓶中，准备130毫升的RPMI媒体相结合，与100毫克/毫升DNase和20毫升5mg/ml Liberase RI的消化酶活性的解决方案。绘制成一个注射器注入胰腺组织10毫升这种解决方案。
4. 注入胰腺组织消化酶的解决方案，旨在它均匀扩张。如果这是防止纤维化，消化，很可能会失败。下一步，组织^3〜4毫米到百果冰块。

4。人的胰腺消化电路

1. 组装消化电路如图1所示。 Ricordi腔中的流动方向是在出室顶部和底部。
2. 其余消化酶液500毫升容量瓶中，加入到300毫升的总量，并插入温度计。
3. 室转移到胰腺组织，插入目（孔径为600微米）和氮化硅大理石（直径：15毫米），接近香港总商会和启动泵与定为140毫升/分钟的流量。
4. 当电路的温度达到37℃，开始计时，并定期抽取样本，以确定何时停止消化。 （2毫克/毫升）双硫腙染色允许微观可视化的胰岛细胞内消化的^组织 4 。
5. 一旦胰岛周围的腺泡组织分开，迅速停止加热线圈放置在冰上，加入200毫升（900毫升的RPMI 1640与5.5毫米的葡萄糖和10％FBS）冷洗媒体电路消化。
6. 收集在250毫升的锥形管胰岛解决方案，因为它散发出来的样品管。继续，直到电路是空的。

图1。人类胰腺消化电路人类胰腺消化电路包括一个Ricordi腔目（孔径为600微米）和三个氮化硅大理石（直径：15毫米） 。从室流出驱动组织收集瓶中，由蠕动泵（140毫升/分）。箭头表示水流方向。酶消化的最佳温度是保持浸泡在37℃水浴加热线圈。

5。洗涤后的消化

1. 离心机含有胰岛解决方案，在1000 rpm，4 ° C 5分钟250毫升锥形管。
2. 弃上清，重悬（900毫升与5.5毫米的葡萄糖和10％胎牛血清的RPMI 1640）洗媒体胰岛颗粒，分布在50 ml锥形管同等分数。 （可选：分发到额外的锥形管，以提高洗涤）离心机在1000 rpm，4℃5分钟。
3. 弃上清，轻轻地松开手册晃动的颗粒。

6。在聚蔗糖梯度的分离纯化

1. 重悬浮颗粒与聚蔗糖媒体密度1.125克/毫升，pH值7.4，慢慢的覆盖密度为1.080，1.060和1.037克/毫升的聚蔗糖媒体10毫升分装。
2. 在2400转离心聚蔗糖梯度，4℃20分钟。

7。胰岛收集和文化

1. 离心后，可以区分不同的组织成分，其分区，在渐变。
2. 弃上层脂肪和结缔组织组成。
3. 仔细收获胰岛总量在1.037-1.060克/毫升相间的第一层。这一层包含了最纯粹的孤立的小岛。收集分数分别为有效地隔离。
4. 收集第二，胰岛总量少纯在1.060-1.080克/毫升相间的一小部分。
5. 加入洗涤介质（900毫升与5.5毫米的葡萄糖和10％胎牛血清的RPMI 1640）每个锥形管总量为50毫升稀释的聚蔗糖梯度。离心机在1000 rpm，4℃5分钟。
6. 丢弃吸上清。使用的颗粒可能会有所松动，由于聚蔗糖梯度的照顾。
7. 洗颗粒无线媒体日洗（900毫升5.5毫米的葡萄糖和10％FBS）的RPMI 1640和1000转的离心机，4 ° C加热5分钟。重复使用胰岛文化传媒
8. 在培养基重悬的小岛，并放置在孵化器，用_5％的CO 2在37℃为24-48小时，然后再进一步加工彗星。

结果

我们的协议取得了平均〜500每克胰腺组织胰岛，虽然这极大地之间的准备工作，这主要是由于纤维化和胶原酶活性的差异不同。胰岛纯度> 90％，实现了用双硫腙染色，在组织处理，然后亲手挑选他们隔离后24小时。要确定纯化的胰岛细胞的质量，我们测试了2小时的静态条件下为25毫米葡萄糖刺激胰岛素分泌。我们发现从ECIT胰岛分离和移植中心获得的胰岛的胰岛素分泌相媲美。从部分pancreatectomized的胰腺中分离出的胰岛并不意味着胰岛移植，评估的总的室内环境不被认为是一个关键因素。

更重要的是，我们的方法，使我们分离部分在²⁰⁰⁵年和2008年5之间的25 pancreatectomized患者胰岛功能的研究。这些胰岛葡萄糖刺激胰岛素分泌和特定的蛋白表达，免疫印迹和免疫组织化学分析。部分pancreatecomized胰腺分离的胰岛细胞也可用于比较基因和蛋白表达谱，超微结构的外观和功能反应的非糖尿病患者和糖尿病胰岛。因为有更多的患者接受部分胰腺切除术相比，有器官捐赠者，我们的协议可能允许强大的统计分析收集到足够的样品和数据。

讨论

使用我们的协议，可以分离出人类胰岛收集从部分胰腺切除胰腺组织。此协议的成功依赖于在几个关键点，采取的护理。为了保护β-细胞的活力，它是必不可少的，迅速运冰实验室标本。此外，必须优化组织消化的时间经验，根据组织纤维化和媒体的酶的活性等级。这也是真正的手动应用Ricordi腔的机械力的程度。因此，取得了良好的胰岛产量，该协议是最好由一个专门的科学家或技术助理。最初的失败是常态，除非球队已经经历胰岛隔离。

有我们的胰岛隔离协议和标准的人类胰岛隔离方法之间的主要区别：1）虽然我们使用在手术过程中受到几个小时的缺血胰腺组织，它是在现场立即处理。这是相反胰腺从胰腺/胰岛移植，这仍然分配和交付胰岛隔离设施过程中的几个小时的缺血，脑死亡捐赠者explanted的。 2）我们直接注入胶原酶的胰腺组织，而标准的协议注入胰管。 3）我们单独使用间断聚蔗糖梯度，而不是使用COBE Cell处理器从一个连续的聚蔗糖梯度收集胰岛的胰岛细胞。

手术标本是太纤维化或隔离胰岛足够数量的稀缺的情况下，组织仍可以检索通过激光捕获显微切割^（LCM）的10。这使得基因表达数据恢复从几乎每一个标本，即使胰岛隔离失败或产量很低。不幸的是，液晶显示模块不生产活细胞功能研究，其金额通常是不足的蛋白质组学分析。因此，在使用LCM与我们的胶原酶消化协议平行检索胰岛可能是最有效的方法来处理手术切除标本。

收集部分pancreatectomies胰岛分离组织时，重要的是要仔细检查病人的临床病史和代谢状态。 3C型糖尿病，即糖尿病继发胰腺疾病导致手术^6，部分pancreatectomized患者可能会受到影响。 43参与我们的部门在2010年接受这种手术的患者中，32名非糖尿病患者，5例2型糖尿病患者和6影响类型3C糖尿病。同意这些数据与以往的研究表明糖代谢受损和糖尿病的一个相当大的患者患有胰头癌或慢性胰腺炎⁶部分。我们认为，糖尿病的主要原产地，如果被诊断至少一年之前的症状，导致^胰腺手术7发病。胰岛自身抗原抗体水平也应测定，以评估潜在的自身免疫性糖尿病⁸来源。由于病人接受胰腺切除可能遭受从确诊糖尿病或葡萄糖不耐，应给予所有非糖尿病患者口服葡萄糖耐量试验之前，胰腺切除术^9。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
名称	公司	目录编号
设备
1毫升血清移液器（蜂星）	格雷纳生物一	604181
10毫升血清移液器（蜂星）	格雷纳生物一	607180
25毫升血清移液器（蜂星）	格雷纳生物一	760180
10 ml注射器	屋宇署（流式细胞Dickinson公司）	300912
50 ml注射器	屋宇署（流式细胞Dickinson公司）	300865
5 ml注射器	屋宇署（流式细胞Dickinson公司）	309050
18 G 1,1 / 2针Microlance 3	屋宇署（流式细胞Dickinson公司）	304622
27 GX1 / 2针	布劳恩	4658300
27 GX3 / 4针Microlance 3	屋宇署（流式细胞Dickinson公司）	302200
3厘米细胞培养皿中的2x2毫米电网	NUNC	174926
20 cm组织培养皿	屋宇署（流式细胞Dickinson公司）	353003
6厘米轻松好握的培养皿	屋宇署（流式细胞Dickinson公司）	351016
150毫升储存瓶	康宁公司	431175
250毫升的锥形瓶	肖特杜兰	21 217 36
500毫升锥形瓶	肖特杜兰	21 217 44
250毫升螺帽锥底离心管	康宁公司	430776
50毫升猎鹰锥形管	屋宇署（流式细胞Dickinson公司）	352070
260毫升Easyflask非治疗	NUNC	156800
Millex GV过滤单元Duropore（0.22微米）	Millipore公司	SLGV033RB
酒瓶上方的真空过滤机（PES的70毫米直径卷材，0.22微米孔径，45毫米脖子大小，500 mL体积）	康宁公司	431118
密度仪（Densito 30PX）LWE37463	梅特勒 - 托利多	51324450
快速PES过滤单元0.2微米	NALGENE	569-0020
加热线圈	BioRep技术公司	HC - 02
Multifuge 4 KS - R	贺利氏	75015680
泵典型PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordi室（600微米孔径的金属网状）	BioRep技术公司	型号的U - 50 - 01，串行0503-001
制备架	BioRep技术公司	50 - PS - 01
O形圈	BioRep技术公司	OR - 50，U - 01
氮化硅大理石9毫米（15集）	BioRep技术公司	SN - 01
硅套管	聚乙烯	ř 3603 8,0 X4，0毫米
手术钳	布劳恩	BD168R
手术剪（蛇牌）	布劳恩	BC273R
水浴OLS是200	津贴	OLS的200
试剂
胶原酶 - > Liberase RI（100毫克）	罗氏公司	11815032001
D（+）-葡萄糖	默克公司	1.08337.1000
二甲基亚砜（DMSO）	默克公司	1.16743.1000
二苯基卡巴腙（DTZ）	西格玛爱秩序	D5130
我DNA酶（100毫克）	罗氏公司	10104159001
Dulbeccos 1xPBS	临时机场管理局实验室	H15 - 002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00509
胎牛血清（FBS）	临时机场管理局实验室	A15 - 101
聚蔗糖400	西格玛爱秩序	F9378
胎儿牛血清（FBS）	Gibco公司	10270-106
2 - （4 - （2 - 羟乙基） - 1 - 哌嗪基）ethansulfons‰URE（HEPES）	罗斯	9105.3
氢氧化钠，5米	临床药学，医院	-
青霉素/链霉素（100倍）	临时机场管理局实验室	P11 - 010
Pipettaid（快递）	屋宇署（流式细胞Dickinson公司）	357591
Potassiumchlo​​rid	Fluka公司	60132
Potassiumdihydrogenphospate无水	JT贝克	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JT贝克	3246-01
中等的RPMI 1640 [ - ] D -葡萄糖[+] L -谷氨酰胺	Gibco公司	11879-020
中等的RPMI 1640 [+] L -谷氨酰胺	临时机场管理局实验室	E15 - 840
Sodiumhydrogencarbonat	默克公司	1.06329.0500