فحوصات الوراثية الدوائية وظيفية للتلاعب تجديد مستورقة Dugesia تفرضه اليابان</em

Summary

نموذج لدراسة جاذبية تمايز الخلايا الجذعية داخل الحيوانات الحية هي دودة مسطحة مستورقة. هو درس تجارب التجديد التي بتر بسيطة التي يتم تنفيذها بسهولة في المختبر الأساسية وقابلة لل(والدوائية الجينية في الجسم الحي رني) التلاعب على النحو الذي فصله البروتوكولات في هذه المقالة.

Abstract

الديدان المفلطحة مستورقة حرة المعيشة لديهم تاريخ طويل من الاستخدام التجريبي نظرا لقدراتهم على التجدد ملحوظة ^1. شظايا صغيرة استئصاله من هذه الحيوانات خطة إصلاح الجسم الأصلي بعد تجديد هياكل الجسم في عداد المفقودين. على سبيل المثال إذا تم قطع جزء أ "الجذع" من دودة سليمة ، 'رئيس' جديد وتجديد الأمامية و"الذيل" سيتم تجديد خلفي استعادة الأصلي الاقطاب "من الرأس إلى الذيل" لهياكل الجسم قبل بتر (الشكل 1A).

والدافع التجدد بواسطة الخلايا الجذعية مستورقة ، والمعروفة باسم 'neoblasts" التي تفرق في ~ 30 أنواع مختلفة من الخلايا خلال توازن الجسم الطبيعي والقسري تجديد الأنسجة. هذه العملية هي التجدد قوية وسهلة في التظاهر. وقد تم الآن نظرا لتفاني مختبرات رائدة عدة ، العديد من الأدوات والأساليب الوراثية وظيفية الأمثل لهذا النظام النموذجي. وبالتالي ، فقد تم إحراز تقدم كبير في الآونة الأخيرة الفهم والتلاعب في الأحداث الجزيئية التي تقوم عليها اللدونة التنموية مستورقة ^2-9.

سيقوم النظام نموذج مستورقة تكون ذات فائدة لمجموعة واسعة من العلماء. للعلماء الأعصاب ، والنموذج يتيح الفرصة لدراسة تجديد نظام العصبي بأكمله ، بدلا من مجرد. إعادة نمو / إصلاح عملية الخلايا العصبية واحد التي عادة ما تكون محور الدراسة في العديد من النماذج القائمة Planarians أعرب عدد كبير من الناقلات العصبية ¹⁰ ، تمثل نظاما هاما لدراسة تطور الجهاز العصبي المركزي ¹¹ و ¹² و السلوكية المحتملة والفرز ^{13 و 14.}

التجدد نتائج قابلة للتلاعب من جانب apparoaches والدوائية الجينية. على سبيل المثال ، يمكن فحص المخدرات للآثار على التجدد ببساطة عن طريق وضع أجزاء الجسم التي تحتوي على المخدرات في حلول في نقاط زمنية مختلفة بعد البتر. ويمكن دراسة دور الجينات الفردية باستخدام أساليب ضربة قاضية ([رني في الجسم الحي) ، والتي لا يمكن أن يتحقق إما من خلال دورات microinjection أو عن طريق تغذية البكتريا ، وأعرب يبني الرنا المزدوج الجديلة ^{8 ، 9 ، 15.} يمكن أن تنتج كلا النهجين الظواهر ضرب بصريا في انتفاذ عالية من أجل التجديد ، ومثال على الحيوانات القطبية الثنائية ^16-21. لتسهيل اعتماد هذا النموذج وتنفيذ مثل هذه الأساليب ، عرض علينا في هذه المقالة بروتوكولات الفيديو لفحوصات والدوائية الجينية (في الجسم الحي عن طريق تغذية رني) باستخدام Dugesia مستورقة تفرضه اليابان.

Protocol

1. مقايسة الجذع جزء التجدد

1. وقف التغذية لفيف من الديدان لمدة لا تقل عن 5 أيام قبل الفحص لضمان التجدد الحيوانات خالية من النفايات والمواد الغذائية المستهلكة (~ 30 الديدان سليمة ، كل دودة ~ 80-10 مم في مرحلة ما بعد الموت جوعا).
2. في يوم من الفحص ، وشطف مسبقا المجمدة طبق الجليد تعادل مع المياه وتغطية سطح مستو المثلج مع غلاف بلاستيكي. باستخدام الملقط ، مكان واحد ورقة تصفية على غلاف بلاستيكي.
3. بلل ورقة الترشيح مع بضع قطرات من مياه الينابيع. نقل planarians على تصفية (<20 الديدان لكل مرشح) باستخدام ماصة نقل. ويمكن تعديل أوضاعها الديدان على التصفية ، إذا اقتضى الأمر ، مع المزيد من المياه repipetting الربيع. إزالة السوائل الزائدة.
4. باستخدام مشرط ، بتر رأسه مرة واحدة من قطع منتصف الطريق تقريبا بين قمة الأمامي من الحيوان ونهاية الأمامي من البلعوم (الشكل 1A).
5. باستخدام مشرط ، بتر منطقة الذيل من قبل مرة واحدة من قطع تقريبا في منتصف الطريق بين ذيل الحيوان ونهاية الخلفي من البلعوم (الشكل 1A). إزالة المخاط الزائد على مشرط باستخدام منشفة ورقية مبللة الايثانول 70 ٪ بعد عدة قطاعات. يمسح الايثانول الزائدة من مشرط.
6. نقل عن طريق تصفية ملقط في طبق بيتري (100 × 25mm العمق) التي تحتوي على مياه الينابيع. انتظر ~ 3 دقائق (لإغلاق الجرح ، يمكن ملاحظتها من قبل معسر وسواد الجرح).
7. شطف شظايا الجذع من ورق الترشيح في طبق بتري تحتوي على المتوسط ​​المطلوب للمقايسة التجدد ونقلها إلى الحاضنة thermostatted (24 درجة مئوية).
8. النمط الظاهري درجة التجدد بعد أسبوع 1 ~ ، عندما هياكل المجددة يمكن تمييزها (الشكل 1A).

2. الدوائية التلاعب التجدد : القطبية الثنائية التي تحدثها البرازيكوانتيل

1. إعداد البرازيكوانتيل (PZQ) الأسهم المخدرات في solubilizing DMSO (62.4mg PZQ في 1mL عن الأسهم 200MM). استخدامها في نفس اليوم.
2. جعل 50mL من المخدرات التي تحتوي على حل (90 PZQ ميكرومتر) في الأملاح Montjuch مخزنة. دوامة لمدة دقيقة 1 ~ لضمان التشتت.
3. إجراء فحص الجذع جزء التجدد على النحو المفصل أعلاه [البروتوكول رقم 1] ، وفضح لفيف من الجذع إلى شظايا PZQ في الخطوة النهائية [1،7].
4. بعد 24-48 ساعة ، وتبادل PZQ التي تحتوي على وسائل الإعلام لمياه الينابيع ، وغسل الديدان عديدة (> 3) مرات.
5. عودة إلى حاضنة الديدان. درجة الاستقطاب الثنائي (اثنان من الرؤساء ، 1B الشكل) بعد أسبوع واحد القطع.

3. التلاعب الجيني للتجديد : المجراة بروتوكول التغذية رني

1. قبل الفحص ، وإعداد الدجاج جناسة الكبد. تجاهل والأصفر الدهنية المقاطع الملونة من foodstock ، وبوريه الكبد المتبقية. تصفية بوريه من خلال مصفاة شبكة وتعليق قسامة للتخزين (1.5mL أنابيب ، -20 درجة مئوية).
2. قبل الفحص ، وإعداد البقري خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) من خلال العرض aliquoting في عينات 1mL وتخزينها في -20 درجة مئوية.
3. حدد الديدان لرني. وتستخدم ثلاثة أفواج : الجينات في المصالح ، والسيطرة الايجابية (الجينات مع النمط الظاهري رني المعروفة ؛ الشكل 1C ، D & E) والسلبية التحكم (مع عدم وجود جينات النمط الظاهري رني ، مفيدة أيضا لتقييم مستويات ضربة قاضية مقارنة مع الأتراب التجريبية). لكل فوج ، واستخدام الديدان ~ 250 (~ 80-10 ملم بعد فترة طويلة من الجوع ما لا يقل عن 5 أيام). تخزين المياه في فصل الربيع في حوض من البلاستيك.
4. لكل سهم الفوج رني ذوبان الجليد ، من التعبير عن الرنا المزدوج الجديلة كولاي استهداف الجينات في المصالح [8] ، جنبا إلى جنب مع أنبوب جناسة كبد الدجاج [3،1] ، وأنبوب من كرات الدم الحمراء [3،2].
5. بيليه البكتيريا (13،000 غرام ، 1 دقيقة). إزالة وطاف بيليه resuspend في وسائل الإعلام 2xYT (~ 700μl). Recentrifuge ، تجاهل طاف ، بيليه مكان على الجليد.
6. إنشاء كبيرة تحمل الطرف ماصة P200 بقطع نهاية الحافة. resuspend بدقة بيليه البكتيرية في خليط من الدجاج جناسة الكبد (150 ميكرولتر) وكرات الدم الحمراء (50 ميكرولتر) لإنشاء رني مزيج التغذية. إزالة فقاعات الهواء عن طريق الطرد المركزي.
7. للتغذية ، وإزالة معظم الماء من الحوض البلاستيك تحتوي على الديدان (إجازة ~ عمق 1 بوصة). الحوض دوامة التركيز الديدان في مركز هذه الحاوية ، وماصة مزيج التغذية رني في دائرة احتضان الديدان. استخدام ماصة نقل بعناية لاقناع الهاربين ليعيدوه الى مزيج التغذية رني دون تكدير بالرواد أخرى!
8. بعد الرضاعة (~ 1 ساعة) ، وتحديد planarians التي تتغذى بشكل جيد. هذه الديدان تظهر تلوين أحمر عميق من كرات الدم الحمراء بلعها. تجاهل الآخرين.
9. استبدال بعناية التغذية حل مع مياه الينابيع العذبة ، والحد من الاضطرابات لمنع ابتراز من المواد الغذائية. للقيام بذلك ، توطين بلطف الديدان إلى جانب واحد من أنبوب نقل باستخدام ماصة ، تتدفق المياه العكرة ، واستبدال بعناية مع سكب المياه العذبة باستمرار على الجدار المقابل للحوض. planarians Resubmerge بأسرع وقت التعرض لفترة طويلة في الهواء ايضا في نتائج ابتراز الغذاء.
10. فضفاضة حد ذاتهابن غطاء الحاوية والعودة إلى الحاضنة (24 درجة مئوية)
11. كرر رني بروتوكول التغذية على مدى دورات متعددة (~ 2-3 أيام بعيدا) ، تتخللها دورات التجدد [بروتوكول # 1] للكشف عن الظواهر رني. ويرد بروتوكول قياسي لتغذية وتجديد فعالة لجينات كثيرة في الشكل 2 ، والتي تأخذ في الشهر ~ 1 المدة الإجمالية.

تعديل هذا النظام لجينات مختلفة ، وبروتوكول الأمثل سوف يعتمد على عوامل مثل الاستقرار مرنا والتطويع اللغوي الأنسجة ، perdurance البروتين ، أو وضع النمط الظاهري الذي يحول دون تغذية دورات متعددة بعد التجديد. تقييم مستويات ضربة قاضية لمجرد فحص بواسطة انتفاذ من النمط الظاهري (إذا كان واضح) ، أو عن طريق نهج qPCR لمقارنة مستويات مستهدفة مرنا مع أتراب السيطرة السلبية.

4. ممثل النتائج :

تجديد جزء مقايسة جذع قوي مثل الديدان وينبغي أن كل تجديد مع ('الرأس الى الذيل') العادي الأمامي الخلفي قطبية. يمكن أن يكون سجل هذا في أقرب وقت بعد خمسة أيام من القطع ، التي سهلت ظهور eyespots الأمامي (asterixed ، الشكل 1A). ومع ذلك ، واستعادة كامل للهياكل شكلية فقد تحدث بعد أسبوع واحد. التلاعب الدوائية للتجديد جزء الجذع بواسطة PZQ الاستسلام برأسين الديدان (1B الشكل) هو أيضا قوية (EC ₅₀ = 87 (+ --) 11 ٪ شظايا القطبين ، 70μM PZQ لمدة 48 ساعة ^20). الثنائية القطبية يحدث أكثر من دورة واحدة على التجدد. أقل فعالية في هذه المقايسات المرجح أن يتصل مع قضايا المخدرات والذوبان / أو تخزين ، أو استخدام أنواع مختلفة حيث PZQ دودة مسطحة غير فعالة. على المخدرات مع انخفاض انتفاذ ، وغالبا ما يستخدم مؤشر anteriorization ليسجل الظواهر وسيطة من ²² جانبا القطبية الثنائية كاملة. وترد الظواهر الناتجة عن رني بنيات مراقبة إيجابية في الشكل 1 : [رني من ستة Dugesia تفرضه اليابان 1 (د ي ستة - 1) ينتج النمط الظاهري بلا عيون ²³ (الشكل 1C) ، [رني من PC2 Dugesia تفرضه اليابان (DJ - PC2) ينتج عن ذلك خسارة للاستجابة النفور من الضوء ²⁴ (1D الشكل) ورني من Dugesia تفرضه اليابان βcatenin - 1 (DJ - βcatenin - 1) النتائج في النمط الظاهري برأسين ^{16-19 ، و 21} شظايا من الجذع (الشكل 1E). ويمكن تحقيق هذه الظواهر باستخدام بروتوكولات رني البسيطة التالية : DJ ستة - 1 (FFxFx) ، DJ - PC2 (FFFx) ، DJ - βcatenin - 1 (FFxFx) ، حيث F = دورة التغذية و x = دورة التجدد على التوالي.

الشكل 1 :... مقايسة جذع تجديد جزء من اليسار ، صورة من مستورقة (أعلى) والتخطيطي (وسط) لإظهار موقع يستأصل جزء الجذع إلى اليمين ، timecourse التجدد جزء الجذع تظهر مظهر جزء تجديد في بعض الأحيان وأشار (أيام) B صورة برأسين مستورقة التي تنتجها التعرض PZQ جيم "بلا عيون" الدودة التي تنتجها دي جي ستة - 1 [رني ملطخة D فقدان استجابة النفور في ضوء متحرك الديدان رني DJ - PC2 (الحمراء الملطخة) ، مقارنة ب دودة التحكم المحمول (. الأخضر). E القطبين مستورقة التي تنتجها DJ - βcatenin - 1 [رني. في BE ، نهاية الأصلي الأمامي من الديدان رني يتجه إلى اليسار.

الشكل 2 : تسلسل التغذية والقطع دورات لبروتوكول نموذجي رني تضم عدة رضعات (F) ، ودورات التجدد (س) التي هي فعالة لضربة قاضية في العديد من الجينات D. تفرضه اليابان. قد تكون هناك حاجة لتعديل هذا البروتوكول عن الجينات الفردية لتحقيق نتائج أفضل ، على سبيل المثال باستخدام. أقل (قوسين) أو عدد أكبر من الدورات والتغذية التجدد

Discussion

وصف البروتوكولات هنا المقايسات لدراسة التفاصيل والتلاعب تجديد Dugesia مستورقة تفرضه اليابان. فهي بسيطة ولا تتطلب مثل هذه المعدات المتخصصة التي يمكن أن أدوا بسهولة في المختبر أو في الفصول الدراسية. يمكن إجراء فحوصات بشكل فردي أو مجتمعة (للصناعات الكيماوية الفحص الجيني للefficacies المخدرات في الجسم الحي) ، ويمكن أداؤها على مستوى الجينات المرشحة ، أو هي قابلة للتكيف مع غير منحازة ، وفحص أعلى إنتاجية ^8. سواء لدراسة علم الأحياء للفضول من planarians في حد ذاتها ، أو لتقييم وظيفة في الجسم الحي من المتماثلات الثدييات في نموذج بديل لدراسة تجديد الأنسجة ، ويجب أن تحفز هذه النهج الفائدة من مجموعة متنوعة من الباحثين.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
الكاشف	بائع	رقم كتالوج	تعليقات
مياه الينابيع	Kandiyohi. قسط شركة مياه مينيابوليس ، مينيسوتا	ن / أ	أشكال أخرى من مياه الينابيع تعمل بشكل جيد أيضا. الأول في المقايسات صلاحية المحاكمة.
1 × مخزنة أملاح Montjuïch : كلوريد الصوديوم (1.6mM) ، CaCl2 (1MM) ، MgSO4 (1MM) ، MgCl2 (0.1mM) ، بوكل (0.1mM) ، NaHCO3 (1.2mM) ، HEPES (1.5mM). 7.4 درجة الحموضة في 24 درجة مئوية.	متعددة البائعين	ن / أ	الاصطناعي للمياه لعلاج المخدرات خلال فحوصات التجدد لضمان التخزين المؤقت الحموضة. حل 08/05 Holtfreter هو بديل.
2xYT مرق	فيشر العلمية	BP2467 - 500	وسائل الإعلام = 31 غ / ل. تعقيمها.
طبق بتري (100x25mm)	فيشر العلمية	08-757-11	الديدان المساكن خلال دورات تجديد
صحن مربع (100x100x15mm)	فيشر العلمية	08-757 - 11A	ملء مع الماء ، علبة الجليد لتجميد تستخدم دودة سطح القطع
الحوض البلاستيك : Ziploc تويست 'ن لوك (16oz).	مختلف تجار التجزئة	ن / أ	صهاريج المياه مريحة ضيق لأفواج رني
الدجاج الكبد	بقالة تجارية	ن / أ	وانحياز واشنطن لوازم العضوية ، نظرا لتجنب المضادات الحيوية.
ومن ناحية خلاط	أي مطبخ المورد	ن / أ	استخدامه لصنع معجون كبد الدجاج
شبكة الأسلاك 1MM مصفاة	أي مطبخ المورد	ن / أ	استخدامها لتوتير هريس الدجاج الكبد
البقري خلايا الدم الحمراء	Lampire المختبرات البيولوجية	7240807	100 ٪ وغسلها المجمعة RBC تعليق
تصفية أوراق دائرية	Whatman # 3	1003 055
نقل الماصة	فيشر العلمية	13-711-41
العقيمة ، شفرات جراحية	متعددة الباعة	ن / أ
± الدواء	سيغما الدريتش	P4668	aliquots مسحوق مخزن في الظلام في 4 درجات مئوية. يجفف.
DJ ستة - 1		بنك الجينات AJ557022.1	رني إيجابية للسيطرة النمط الظاهري "العين أقل" (23)
DJ - βcatenin - 1		بنك الجينات AB181913.1	رني السيطرة الإيجابية التي ترأسها لمدة 17 النمط الظاهري
DJ - PC2			رني مراقبة إيجابية عن خسارة النمط الظاهري ضوء النفور 24