Фармакологические и функциональные Генетические анализы манипулировать Регенерация планарии Dugesia японская</em

Резюме

Привлекательной моделью для изучения дифференциации стволовых клеток в живых животных планарии плоских червей. Регенерация изучается простых экспериментов ампутации, которые легко выполняются в основной лаборатории и поддаются фармакологических и генетических ( В естественных условиях RNAi) манипуляции чем подробно протоколы в этой статье.

Аннотация

К свободно живущим плоские черви планарии имеют давнюю историю экспериментальных из-за использования в их замечательный регенеративных способностей ^1. Малые фрагменты вырезали из этих животных реформы первоначальный план тело после регенерации отсутствующих структур тела. Например, если фрагмент "ствол" вырезан из нетронутыми червя, «голова» новый будет восстанавливаться спереди и "хвост" будет восстанавливаться сзади восстановление первоначальных полярности "голова-хвост" тело структур до ампутации (рис. 1А).

Регенерация обусловлена ​​планарии стволовых клеток, известных как "необласты", которые дифференцируются в ~ 30 различных типов клеток во время нормального гомеостаза тела и насильственные регенерации тканей. Это процесса регенерации является надежной и легко доказать. Благодаря самоотверженности нескольких новаторских лабораторий, множество инструментов и функциональных генетических методов в настоящее время оптимизированы для данной модели системы. Следовательно, в последнее время значительные успехи были достигнуты в понимании и манипулирования молекулярных событий основу планарии развития пластичности ^2-9.

Планарии системы модель будет представлять интерес для широкого круга ученых. Для неврологов, модель дает возможность изучить регенерацию всей нервной системы, а не просто отрастания / ремонт единый процесс нервных клеток, которые обычно находятся в центре внимания исследования во многих существующих моделей. Планарий выразить множество нейротрансмиттеров ^10, представляют собой важный система для изучения эволюции центральной нервной системы, ^{11, 12} и поведенческих потенциал скрининг ^{13, 14.}

Регенеративной результаты поддаются манипуляции с помощью фармакологических и генетических apparoaches. Например, препараты могут пройти обследование на воздействие на регенерацию просто поставив фрагменты тел в наркосодержащих решений в различные моменты времени после ампутации. Роль отдельных генов могут быть изучены с помощью методов нокдаун (в естественных условиях RNAi), которая может быть достигнута либо через циклы микроинъекции или путем подачи бактериально-выразил дсРНК конструкции ^{8, 9, 15.} Оба подхода могут производить визуально поразительный фенотипы при высокой пенетрантностью, например, регенерация животных биполярного ^16-21. Для облегчения принятия этой модели и реализация таких методов, мы демонстрируем в этом видео статьи протоколов для фармакологических и генетические анализы (в естественных РНК-интерференции путем подачи) с использованием планарии Dugesia айва японская.

протокол

1. Магистральные фрагмент регенерации анализа

1. Стоп кормления когорте червей, по крайней мере за 5 дней до регенеративных анализа для обеспечения животные свободны от отходов и съеденной пищи (~ 30 нетронутыми червями, каждый червь ~ 8-10 мм длиной после голодания).
2. В день анализа, промыть предварительно замороженных выровняли лед блюдо с водой и накройте плоской ледяной поверхности полиэтиленовой пленкой. Использование щипцов, положите фильтровальную бумагу на полиэтиленовой пленкой.
3. Смочите фильтровальная бумага с несколькими каплями родниковой водой. Передача планарий на фильтр (<20 червей на фильтр) с помощью передачи пипетки. Черви могут быть перемещены на фильтр, при необходимости, repipetting с более родниковой водой. Удалите излишки жидкости.
4. Использование скальпеля, ампутировать голову одного отсечения примерно на полпути между передней вершина животных и переднему концу глотки (рис. 1А).
5. Использование скальпеля, ампутировать хвост регион одним отсечения примерно на полпути между задней части животного и заднему концу глотки (рис. 1А). Удалите излишки слизи на скальпель использованием бумажным полотенцем смоченным 70% этанола после резки. Протрите избыток этанола из скальпеля.
6. Передача через фильтр щипцов в чашку Петри (100 х 25 мм глубиной), содержащий родниковой водой. Подождите, ~ 3 минуты (для закрытия раны, наблюдаемые щипать и затемнения раны).
7. Промыть ствол фрагменты из фильтровальной бумаги в чашку Петри содержащие желаемый средой для регенеративной анализа и передачи термостатируемый инкубатор (24 ° С).
8. Оценка восстановительной фенотипа после ~ 1 недели, при регенерации структур могут быть идентифицированы (рис. 1А).

2. Фармакологические манипуляции регенерации: биполярности индуцированных празиквантела

1. Подготовка празиквантел (PZQ) акции на солюбилизирующие наркотиков в ДМСО (62.4mg PZQ в 1 мл 200 мМ для акций). Использование на тот же день.
2. Сделайте 50 мл лекарственного раствора, содержащего (90 мкМ PZQ) в буферных солей Montjuch. Vortex в течение ~ 1 минуты, чтобы гарантировать дисперсии.
3. Выполните фрагмент ствола регенеративной анализа, как описано выше [протокол № 1], подвергая когорты магистральных фрагментов PZQ на последний шаг [1,7].
4. После 24-48 часов, обмен PZQ средах для родниковая вода, стиральная червей несколько (> 3) раза.
5. Вернуться червей в инкубатор. Оценка биполярность (две головы, рисунок 1b) через неделю после резки.

3. Генетические манипуляции регенерации: в естественных условиях протокол кормления RNAi

1. До анализа, подготовки гомогената куриной печени. Отменить жирной, желтого цвета разделы foodstock, и пюре из оставшихся печени. Фильтры пюре через сито петли и аликвоту суспензии для хранения (1,5 мл труб, -20 ° С).
2. До анализа, подготовки бычьего красных кровяных телец (эритроцитов) путем aliquoting питания в 1 мл образцы, хранимые при температуре -20 ° C.
3. Выбор червей для РНК-интерференции. Три когорты используются: интерес гена, положительный контроль (ген с известными фенотип RNAi, рисунок 1С, D & E) и отрицательный контроль (ген, не фенотип RNAi, также полезны для оценки нокдаун уровней по сравнению с экспериментальной группы). Для каждой когорты, используйте ~ 250 червей (~ 8-10 мм длиной после голодали в течение минимум 5 дней). Хранить в родниковую воду в пластиковые ванны.
4. Для каждой когорте RNAi, оттепель запас E.coli, выразив дсРНК ориентации интересующего гена [8], вместе с трубкой куриного гомогената печени [3,1] и трубки эритроцитов [3,2].
5. Гранул бактерий (13 000 г, 1 минута). Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 2xYT СМИ (~ 700μl). Recentrifuge, отбросить супернатант, место гранул на льду.
6. Создание большого диаметра P200 пипетки, отрезав конец наконечника. Тщательно ресуспендирования бактериальных гранул в смеси гомогената куриной печени (150 мкл) и эритроцитов (50 мкл) для создания RNAi кормления смесью. Удалить пузырьки воздуха с помощью центрифугирования.
7. Для кормления, удаления большинства воду из пластиковой раковине под червей (оставьте ~ 1 дюйм глубины). Вихревые ванны сосредоточиться червей в центре этого контейнера, а пипетка RNAi подача смеси в кругу corralling червей. Используйте передачу пипеткой тщательно коаксиальный беглецов обратно на смесь кормления RNAi без возмущающих других посетителей!
8. После кормления (~ 1 час), определить планарий, которые кормят хорошо. Эти черви показать глубокий красный цвет от попадании эритроцитов. Отменить другие.
9. Тщательно заменить кормление решение с родниковой воды, сводя к минимуму нарушения, чтобы предотвратить экскреции пищи. Чтобы сделать это, мягко локализовать червей к одной стороне трубки использованием передачи пипетки вылить мутной воде, и тщательно заменить пресную воду лил противоположной стенке ванны. Resubmerge планарий быстро, как длительное пребывание на воздухе также приводит к экскреции пищи.
10. Слабо себедр. крышкой контейнера и вернуться в инкубатор (24 ° С)
11. Повторите RNAi кормления протокола в течение нескольких циклов (~ 2-3 дня друг от друга), чередующиеся с регенеративных циклов [протокол № 1] для выявления фенотипов RNAi. Стандартный протокол для питания и регенерации эффективным для многих генов показан на рисунке 2, который занимает ~ 1 месяца в общей продолжительности.

Изменить эту схему для разных генов, а оптимального протокола будет зависеть от таких факторов, как стабильность мРНК, тканевой локализации белка perdurance, или развитие фенотипа, что исключает многократные циклы питания после регенерации. Оценка нокдаун уровней просто скрининга пенетрантностью фенотипа (если очевидно), или КПЦР подходы сравнить целевые уровни мРНК с отрицательным когорты контроля.

4. Представитель результаты:

Регенерации ствол фрагмент анализа является надежной, что все черви должны регенерировать с нормальным передне-задней («голова к хвосту») полярности. Это может быть засчитан, как только через пять дней после резки, способствовало появлению передней глазных пятен (asterixed, рисунок 1А). Тем не менее, полное морфологическое восстановление утраченных структур происходит после одной недели. Фармакологические манипуляции магистральных регенерации фрагмента PZQ уступить двуглавый червей (рис. 1В) также надежная (ЕС ₅₀ = 87 (+ -) 11% биполярных фрагменты, 70μM PZQ на 48 часов ^20). Биполярность происходит в течение одного регенеративного цикла. Нижняя эффективность в этих анализах вероятно, относится к проблемам с растворимостью препарата и / или хранение или использование различных видов плоских червей, где PZQ неэффективно. Для препаратов с низкой пенетрантностью, anteriorization индекс часто используется для оценки промежуточных фенотипов в стороне от завершения ²² биполярности. Фенотипы в результате RNAi положительных конструкции управления показаны на рисунке 1: RNAi из Dugesia японской шесть-1 (D J-шесть-1) приводит к фенотипу безглазые ²³ (рис. 1C), РНК-интерференции в Dugesia японской PC2 (Dj-PC2) приводит к потере света ответа отвращение ²⁴ (Рис. 1D) и РНК-интерференции в Dugesia японской βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) приводит к двуглавый фенотип ^{16-19, 21} из ствола фрагментов (рис. 1E). Эти фенотипы можно достичь с помощью следующих простых RNAi протоколов: Dj-шесть-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), где F = кормления цикла и х = регенеративного цикла соответственно.

Рисунок 1:... Магистральные фрагмент регенерации анализа левых, образ планарии (вверху) и схемы (в середине), чтобы показать расположение ствола вырезали фрагмент правой, timecourse магистральных регенерации фрагмент показывает появление фрагмента регенерирующим по указанной раза (в днях) B Изображение двуглавого планарии, полученных посредством воздействия PZQ. Eyeless 'C червя производства Dj шесть-1 РНК-интерференции. D потери света реакция неприятия в неподвижном Dj-PC2 RNAi червей (пятна красного цвета), по сравнению с мобильного червя контроля (витражи зеленый). E Биполярный планарии производства Dj-βcatenin-1 РНК-интерференции. В ВЕ, оригинальный передний конец RNAi червей, ориентированных на левой.

Рисунок 2: Последовательность подачи и резки циклов для типичных протокол RNAi включающий несколько кормлений (F), и восстановительные циклы (х), что является эффективным для нокдаун многих генов в D. айва японская. Модификация этого протокола для отдельных генов могут быть необходимы для получения оптимальных результатов, например, используя меньше (скобки) или большее количество предметов для кормления и регенеративных циклов.

Обсуждение

Протоколы, описанные здесь подробно тесты для изучения и манипулирования регенерации Dugesia планарии японская. Они просты и не требуют специального оборудования таковы, что они могут быть легко выполнены в лаборатории или классе. Анализы могут быть выполнены индивидуально или в комбинации (для химических генетического скрининга лекарственных эффективностями в естественных условиях) и может быть выполнена на уровне генов кандидата, или могут быть адаптированы к объективной, более высокую пропускную способность скрининга ^8. Ли для изучения интригующим биологии планарий сами по себе, или для оценки в естественных условиях функцию млекопитающих гомологов в альтернативной моделью для изучения регенерации тканей, эти подходы должны стимулировать интерес со стороны широкого круга исследователей.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагент	Продавец	Номер по каталогу	Комментарии
Ключевая вода	Kandiyohi. Премиум Воды ООО Minneapolis, MN	н /	Другие формы родниковой воды также хорошо работать. Судебная первый в жизнеспособности анализов.
1 х буферизованной Montjuich соли: NaCl (1,6 мм), CaCl2 (1 мм), MgSO4 (1 мм), MgCl2 (0,1 мм), KCl (0,1 мм), NaHCO3 (1,2 мм), HEPES (1,5 мм). рН 7,4 при 24 ° C.	Несколько поставщиков	н /	Искусственные воды для медикаментозного лечения во время регенеративной анализов для обеспечения рН буферизации. Решение 5 / 8 Holtfreter является альтернативой.
2xYT Отвар	Fisher Scientific	BP2467-500	Медиа = 31 г / л. Автоклавного.
Чашка Петри (100x25mm)	Fisher Scientific	08-757-11	Жилищный червей в процессе регенерации циклов
Площадь Блюдо (100x100x15mm)	Fisher Scientific	08-757-11A	Залейте водой, заморозить для льда лоток используется как червь режущей поверхности
Пластиковые ванны: п Ziploc Твист "Loc (16 унций).	Различные розничной торговли	н /	Удобный водонепроницаемый контейнеры для когорты RNAi
Куриной печени	Коммерческая продуктовый	н /	Уклон в сторону органических материалов, благодаря избежании антибиотиков.
Ручной блендер	Любая кухня поставщиком	н /	Используйте для приготовления пюре из куриной печени
Wire Mesh сито 1 мм	Любая кухня поставщиком	н /	Используйте для напряжения пюре из куриной печени
Говядина красных кровяных телец	Lampire биологических лабораторий	7240807	100% мытый и объединенных РБК подвески
Циркуляр фильтровальная бумага	Ватман № 3	1003 055
Передача Внесите	Fisher Scientific	13-711-41
Стерильные, хирургические лезвия	Несколько поставщиков	н /
± Празиквантел	Sigma Aldrich	P4668	Магазин порошок аликвоты в темноте при 4 ° C. ПЕРЕСУШИВАЙТЕ.
Dj-шесть-1		GenBank AJ557022.1	RNAi положительного контроля для "глаз-менее" фенотип 23
Dj-βcatenin-1		GenBank AB181913.1	RNAi положительного контроля для двуглавый фенотипа 17
Dj-PC2			RNAi положительный контроль за потерю света фенотип отвращение 24