药理和功能的遗传分析处理涡虫的再生日本三角涡虫</em

摘要

在一个活的动物研究干细胞分化的一个有吸引力的模式是涡虫扁虫。再生是由简单的截肢手术，很容易在一个基本的实验室进行的实验研究和药理学和基因（适合在体内 RNAi）的操纵，在这篇文章中的协议详细。

摘要

自由生活涡虫扁虫有一个历史悠久的实验使用，因为他们非凡的再生^能力 1 。从这些动物切除的小片断，改革原体计划，缺少的车身结构的再生。例如，如果一个“主干”的片段是从一个完整的蠕虫切割，一个新的“头”将再生前方一个“尾巴”后方将重新恢复了原有的“头部到尾部的车身结构的极性截肢前（图1A）。

涡虫被称为“neoblasts'〜30种不同类型的细胞分化，在正常的身体动态平衡和执行组织再生的干细胞，是由再生。这种再生过程是可靠和容易证明。由于几个创业实验室，许多工具和功能基因的方法的奉献精神，现在已经为这个模型系统进行了优化。因此，相当最近已经取得了进展，在理解和操作^基础 2-9涡虫的发育可塑性的分子事件。

涡模型系统将会以一个科学家的广泛利益。神经学家，模型给予机会研究整个神经系统的再生，而不是简单的再生/修复单个神经细胞的过程中，通常是在许多已建立的模型研究的重点。涡虫表达的神经递质¹⁰过多，代表的一项重要制度，为研究中枢神经系统^的11，12的演变，行为甄别潜在^的13，14 。

再生的结果是经得起药理和遗传apparoaches操纵。例如，可以进行筛选药物对再生的影响，只需放置在身体片段的药物含截肢后在不同时间点的解决方案。使用击倒方法（ 在体内的RNAi），这可以实现，通过显微注射周期或喂食细菌表达双链RNA的^{结构8，9，15，}可以研究单个基因的作用。这两种方法都可以产生高外显率，例如，双极动物^16-21再生的视觉冲击的表型。为了便于采用这种模式和实施这种方法，我们将展示使用涡虫日本三角涡虫的药理学和基因检测（在体内RNAi技术通过喂食）的视频在这条协议。

研究方案

1。中继片段再生实验

1. 再生实验前至少5天停喂的蠕虫病毒的队列，以确保动物废物和摄取食物（30〜完整的蠕虫，每个蠕虫〜8-10毫米长的饥饿后）的。
2. 在检测的一天，冲洗与水预先冷冻的平整的冰盘，并用保鲜膜覆盖平的冰面。使用镊子，一个滤纸上的保鲜膜。
3. 几滴泉水浸湿的滤纸。转移到过滤器使用的移液管（<20％过滤蠕虫）涡虫。蠕虫过滤器，如果有必要可以重新定位，通过与更多的泉水repipetting。删除多余的液体。
4. 使用手术刀，截肢动物的前尖，咽（ 图1A）前结束之间约中途一个单切头。
5. 使用手术刀，截去尾部区域，由一个单一的削减约中间动物的尾部和后咽（ 图 1A）结束。删除多余的粘液，用手术刀切割后蘸用70％乙醇的纸巾。用手术刀多余的乙醇。
6. 转移到培养皿中（100 x 25毫米深）通过含有泉水钳过滤器。等待〜3分钟（伤口缝合，观察一个捏和伤口变黑）。
7. 冲洗干净，滤纸的Petri菜含有所需再生法和转移到恒温培养箱（24℃）介质的主干片段。
8. 分数再生表型〜1周后，当再生结构识别（ 图 1A） 。

2。吡喹酮诱导再生：两极药理操纵

1. 准备溶药物在DMSO（62.4mg 1ML PZQ 200MM股票）吡喹酮（PZQ）的股票。当天使用。
2. 设为50毫升含药溶液中缓冲Montjuch盐（PZQ 90微米）。涡〜1分钟，以确保分散。
3. 执行主干片段[＃1]，露出的树干碎片队列的最后一步[1.7] PZQ协议的详细以上的再生法。
4. 24-48小时后，交换PZQ含有温泉水的媒体，洗衣机蠕虫（> 3）次。
5. 返回蠕虫孵化器。分数两极（两个头， 图1B）切割后的一周。

3。再生的基因操作：在体内RNAi的喂养协议

1. 检测前，准备鸡肝匀浆。丢弃从foodstock脂肪，黄颜色的部分，菜泥其余肝。过滤菜泥通过滤网和存储等分悬浮液（1.5ml离心管，-20℃）。
2. 检测之前，准备aliquoting到1ML样品供应，储存于-20 ° C牛的红血细胞（红细胞）
3. 选择用于RNAi的蠕虫病毒。三个同伙：感兴趣的基因，阳性对照组（基因与已知的RNA干扰表型;图1C，D和 E）和负控制（无RNAi的表型的基因，也有用的评估击倒水平相比，实验队列）。对于每个队列，使用〜250的蠕虫（〜8-10毫米长至少5天的饥饿后）。存放在塑料桶泉水。
4. 对于每个RNAi的队列中，大肠杆菌表达dsRNA的目标感兴趣的基因大肠杆菌解冻股票[8]，随着鸡肝匀浆管[3.1]和红细胞管[3.2]。
5. 佩莱细菌（13000克，1分钟）。移除上清液2xYT媒体（〜700μl）和重新悬浮颗粒。 Recentrifuge，在冰上，丢弃上清液，沉淀的地方。
6. 创建大缸径P200的枪头，切断提示结束。在鸡肝匀浆（150μL）和红细胞（50μL）的混合物创建RNAi的喂养混合彻底重悬细菌沉淀。取出离心中的气泡。
7. 觅食，删除包含蠕虫的塑料浴盆的水多数（离开〜1英寸深入）。涡流浴缸集中在这个容器中的中心的蠕虫，和吸管RNAi在一个网罗蠕虫圈饲养的组合。请使用移液管，仔细同轴电缆上的RNAi喂养混合逃出，没有其他食客的干扰！
8. 喂奶后（约1小时），确定，美联储以及涡虫。这些蠕虫从摄入的红细胞深红色着色。丢弃他人。
9. 小心地更换新鲜的泉水喂养的解决方案，最大限度地减少干扰，防止食物的排泄。要做到这一点，轻轻地本地化蠕虫使用移液管的管的一侧，倒入水混浊，并仔细地用清水取代倾盆而下的浴缸对面的墙上。长时间暴露在空气Resubmerge涡虫很快也会导致食物排泄。
10. 松散SE铝容器的盖子，并返回到培养箱（24℃）
11. 重复RNAi在多个周期中喂养协议（〜2-3天），穿插协议＃1]屏幕RNAi的表型再生周期。许多基因的有效供料和再生的一个标准协议显示在图2〜1个月，总工期。

修改这个计划，针对不同的基因作为最佳的协议将取决于mRNA的稳定性，组织定位，蛋白质perdurance，或排除多个喂养周期后再生一个表型的发展等因素。评估只是表型的显性筛选（明显），或定量PCR方法，有针对性的mRNA水平与阴性对照队列击倒水平。

4。代表性的成果：

主干片段再生实验是健壮的所有蠕虫应重新正常前后（“头到尾”）极性。这可以切割后的5天，前眼点（asterixed图1A）的出现，促成尽快拿下。然而，一周后完成恢复失去结构的形态发生。药理操纵主干片段再生PZQ产量双头蠕虫（ 图1B）也很强大（欧共体₅₀ = 87（+ - ）11％的双极片段，70μM为48 ^小时 20 PZQ） 。两极发生在一个单一的再生周期。下在这些实验的疗效可能与药物的溶解度和/或存储，或使用不同的扁虫种PZQ是无效的问题。对于外显率较 ​​低的药物，通常用于anteriorization指数得分^从 22完整的两极的中间表型搁置。表型从积极的控制结构的RNAi， 如图1所示：RNAi 的日本三角涡虫6 - 1（D J六个- 1）的结果，在无眼^表型23（ 图 1C），日本三角涡虫的PC2的RNAi（DJ - PC2）在损失厌恶的光响应^24（ 图1D）和RNAi的结果， 日本三角涡虫βcatenin- 1（βcateninDJ - 1）的结果在两个为首的表型^16-19日，从主干片段（ 图^1E）21。这些表型，可以实现用下面这个简单的RNA干扰协议：DJ -六（FFxFx），DJ - PC2（FFFx），DJ -βcatenin- 1（FFxFx），其中F =饲养周期和x =分别再生周期。

图1：主干片段再生检测涡虫（上）和原理图（中） 左 ，形象地展现切除主干片段的位置。右键，躯干片段再生timecourse显示外观再生片段在指定的时间（天）乙PZQ曝光产生。双头涡虫的图像C“无眼”DJ -六- 1 RNA干扰，D动的DJ - PC2的RNAi蠕虫（染成红色）轻厌恶反应，亏损相比，移动控制蠕虫（染色产生的蠕虫绿色），E双极型涡虫的DJ -βcatenin1的RNAi 。在Be，原来的RNAi蠕虫前到底是面向左侧。

图2：典型RNAi的协议包括多个喂养（F）和再生周期（X）是有效的 D.许多基因敲除喂养和切割周期序列粳稻 。本议定书的个体基因可能需要修改，​​以产生最佳的结果，使用例如一个较少（括号）或更大数量的喂养和再生周期。

讨论

这里描述协议详细分析，研究和操纵涡虫三角涡虫再生的粳稻。他们很简单，不需要专用设备等，他们可以很容易地在实验室或教室进行。分析可以单独进行，或合并化学药物药效在体内的基因筛查，可以在候选基因水平上进行，或适应无偏见的，高通量^筛选 8 。无论是耐人寻味的涡虫的生物学研究自己的权利，或在体内功能在哺乳动物的同源性研究组织再生的替代模型的评估，这些方法应推动多元化的研究人员的兴趣。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂	供应商	目录编号	评论
泉水	Kandiyohi。高级沃特公司明尼苏达州明尼阿波利斯	N / A	其他形式的泉水也很好。审判第一的可行性分析。
1 ×缓冲蒙特伊克（Montjuich）盐：氯化钠（1.6毫米），氯化钙（1MM），硫酸镁（1MM），氯化镁（0.1MM），氯化钾（0.1毫米），碳酸氢钠（1.2MM），HEPES（1.5）。 pH值7.4在24 ° C。	多个供应商	N / A	人工水再生实验期间的药物治疗，以确保pH缓冲。 5 / 8 Holtfreter的解决方案是一个另类。
2xYT肉汤	Fisher Scientific则	BP2467 - 500	媒体= 31 g / L的。高压灭菌。
培养皿（100x25mm）	Fisher Scientific则	08-757-11	在再生周期的房屋蠕虫
广场菜（100x100x15mm）	Fisher Scientific则	08 - 757 - 11A	与水，冻结填补蠕虫切割面的冰盘
塑料桶：密保诺拉链式扭'N LOC（16盎司）。	各种零售商	N / A	便民水密封容器内的RNAi同伙
鸡肝	商业杂货店	N / A	偏见，对有机用品，由于避免抗生素。
手搅拌机	任何厨房供应商	N / A	使用鸡肝脏原浆
电线1毫米滤网	任何厨房供应商	N / A	使用使劲鸡肝脏原浆
牛红细胞	Lampire生物实验室	7240807	冲到100％，并汇集了红细胞悬浮液
圆形滤纸	的Whatman＃3	1003 055
移液管	Fisher Scientific则	13-711-41
无菌，手术刀	多个供应商	N / A
±吡喹酮	西格玛爱秩序	P4668	在黑暗中商店粉末分装在4 ° C变干。
DJ -六1		GenBank中AJ557022.1	RNAi的“眼”23表型阳性对照
DJ -βcatenin- 1		GenBank中AB181913.1	RNAi的阳性对照两个为首的表型 17
DJ - PC2			RNAi的阳性对照光厌恶表型24损失