מבחני גנטית תרופתי ו פונקציונלית לתפעל התחדשות של Planarian Japonica Dugesia</em

Summary

מודל אטרקטיבי עבור הלומדים תא גזע בידול בתוך החי הוא התולעת השטוחה planarian. התחדשות הוא למד על ידי ניסויים פשוטים קטיעה מבוצעים בקלות במעבדה בסיסי הנוחות (תרופתי ו גנטית In vivo RNAi) מניפולציה כמפורט על ידי פרוטוקולי במאמר זה.

Abstract

חופשי חיים תולעים שטוחות planarian יש היסטוריה ארוכה של שימוש ניסיוני בשל היכולות משובי מדהים שלהם ^1. שברים קטנים נכרת מבעלי חיים אלה את תוכנית הרפורמה הגוף המקורי בעקבות התחדשות של מבנים בגוף חסר. לדוגמה, אם שבר "המטען" נחתך מן התולעת בשלמותה, "ראש" חדש יתחדשו anteriorly ו 'זנב' יתחדשו בדיעבד שחזור המקורי הקוטביות "ראש אל זנב" של מבנים בגוף לפני קטיעה (איור 1A).

התחדשות הוא מונע על ידי בתאי גזע planarian, המכונה "neoblasts" אשר להתמיין ~ 30 סוגי תאים שונים במהלך הומאוסטזיס הגוף נורמלי התחדשות רקמות נאכף. תהליך ההתחדשות הוא חזק וקל להוכיח. בשל חנוכת המעבדות חלוצי מספר כלים רבים ושיטות גנטית תפקודית יש עכשיו מערכת אופטימיזציה עבור מודל זה. כתוצאה מכך, התקדמות האחרונות ניכרת נעשתה בהבנה לתמרן את האירועים המולקולריים שבבסיס פלסטיות התפתחותית planarian ^2-9.

מערכת מודל planarian יהיה לעניין מגוון רחב של מדענים. עבור מדעני מוח, המודל מאפשר את ההזדמנות ללמוד את התחדשות של מערכת העצבים כולה, ולא רק לצמיחה מחודשת / תיקון של תהליך תא עצב יחיד, כי בדרך כלל הם מוקד המחקר במודלים הוקמה רבים. Planarians להביע שפע של נוירוטרנסמיטרים ^10, מייצגים מערכת חשוב לחקר האבולוציה של מערכת העצבים המרכזית, ^{11, 12} יש פוטנציאל ההקרנה התנהגות ^{13, 14.}

תוצאות משובי ניתנים למניפולציה על ידי apparoaches תרופתי ו גנטית. לדוגמה, תרופות יכול להיות מוקרן על ההשפעות על התחדשות פשוט על ידי הנחת שברי גוף סמים המכילים פתרונות בנקודות זמן שונות לאחר קטיעה. תפקידה של גנים בודדים ניתן ללמוד בשיטות מציאה (in vivo RNAi), אשר יכולה להיות מושגת גם דרך מחזורי microinjection או האכלה bacterially, הביע בונה dsRNA ^{8, 9, 15.} שתי הגישות יכול לייצר פנוטיפים מרשים ויזואלית על התחדשות גבוהה penetrance-עבור, למשל של חיות דו קוטבית ^16-21. כדי להקל על אימוץ של מודל זה ויישום של שיטות כאלה, אנחנו ראווה מאמר זה פרוטוקולים וידאו עבור מבחני תרופתי וגנטיים (in vivo RNAi על ידי האכלה) באמצעות Dugesia planarian japonica.

Protocol

1. שבר Trunk התחדשות assay

1. להפסיק להאכיל קבוצה של תולעים לפחות 5 ימים לפני assay משובי כדי להבטיח חיים חופשיים של פסולת מזון מעובדים (~ 30 תולעים תמים, כל תולעת ~ 8-10 מ"מ אורך הפוסט רעב).
2. ביום של assay, לשטוף צלחת מראש קפוא קרח מפולס עם מים מכסים את פני השטח קר שטוח בניילון נצמד. בעזרת מלקחיים, במקום אחד נייר לסנן על עטיפת הפלסטיק.
3. להרטיב את נייר הסינון עם כמה טיפות של מי המעיין. העברת planarians על מסנן (<20 תולעים לכל פילטר) באמצעות פיפטה ההעברה. תולעים ניתן למקמו מחדש על המסנן, במידת הצורך, על ידי repipetting עם מי מעיינות יותר. הסר את הנוזלים העודפים.
4. באמצעות אזמל, לכרות את ראשו על ידי חתך אחד עשה בערך באמצע הדרך בין הקודקוד הקדמי של החיה, ואת הקצה הקדמי של הלוע (איור 1A).
5. באמצעות אזמל, לכרות באזור הזנב על ידי חתך אחד עשה בערך באמצע הדרך בין קצה הזנב של החיה ולסיים האחורי של הלוע (איור 1A). הסר ליחה על האזמל באמצעות מגבת נייר טבולה אתנול 70% לאחר חיתוך. נגב אתנול עודף אזמל.
6. העברה דרך מסנן מלקחיים לתוך צלחת פטרי (100 x 25mm עומק) המכיל מים באביב. חכו ~ 3 דקות (לסגירת הפצע, נצפים על ידי צובט ו המחשיך של הפצע).
7. יש לשטוף את שברי המטען מנייר מסנן לתוך צלחת פטרי המכילה בינוני הרצוי עבור assay העברת משובי כדי thermostatted בחממה (24 ° C).
8. ציון פנוטיפ משובי אחרי שבוע ~ 1, כאשר המבנים מחדש ניתנים לזיהוי (איור 1A).

2. מניפולציה תרופתי של התחדשות: bipolarity המושרה על ידי praziquantel

1. הכן praziquantel (PZQ) מניות על ידי תרופה solubilizing ב DMSO (62.4mg PZQ ב 1mL עבור המניות 200 מ"מ). השתמש ב באותו יום.
2. בצע 50 מ"ל של תמיסת תרופות המכילות (90 מיקרומטר PZQ) ב מלחים Montjuch שנאגרו. וורטקס דקה 1 ~ כדי להבטיח פיזור.
3. ביצוע קטע המטען assay משובי כמפורט לעיל [פרוטוקול מס '1], חושפת קבוצה של שברי המטען כדי PZQ בשלב האחרון [1.7].
4. לאחר 24-48 שעות, חילופי PZQ המכילים המדיה עבור מי המעיין, כביסה כמה תולעים (> 3) פעמים.
5. חזור תולעים חממה. Bipolarity ציון (שני ראשים, איור 1B) שבוע לאחר חיתוך.

3. מניפולציה גנטית של התחדשות: בפרוטוקול האכלה RNAi vivo

1. לפני assay, להכין כבד עוף homogenate. בטל שומן, חלקים בצבע צהוב foodstock, והכבד פירה הנותרים. סנן פירה דרך מסננת רשת ההשעיה aliquot לאחסון (1.5mL צינורות, -20 ° C).
2. לפני assay, להכין שור בתאי הדם האדומים (RBCs) על ידי אספקת aliquoting לתוך דגימות 1mL, המאוחסן ב -20 ° C.
3. בחר תולעים עבור RNAi. שלוש קבוצות משמשים: הגן של עניין, בקרה חיובית (גן עם פנוטיפ RNAi ידועים; תרשים 1C, D & E) בקרה שלילית (גן עם פנוטיפ לא RNAi, שימושי גם עבור הערכה של רמות מציאה לעומת המחזור ניסיוני). עבור כל קבוצה, השתמש ~ 250 תולעים (~ 80-10 מ"מ זמן רב לאחר רעב במשך לפחות 5 ימים). חנות במי מעיינות בגיגית פלסטיק.
4. עבור כל המניות, להפשיר RNAi עוקבה של E. coli להביע dsRNA גן מיקוד של עניין [8], יחד עם שפופרת של homogenate כבד עוף [3.1] ו שפופרת של RBCs [3.2].
5. גלולה חיידקים (13,000 גרם, 1 דקה). הסר supernatant ו resuspend גלולה ב 2xYT התקשורת (~ 700μl). Recentrifuge, להשליך supernatant, מקום גלולה על הקרח.
6. צור גדול נשא P200 קצה פיפטה ידי ניתוק סוף של קצה. ביסודיות resuspend גלולה חיידקים בתערובת של כבד עוף homogenate (150 μL) ו RBCs (50 μL) כדי ליצור תערובת RNAi האכלה. הסר בועות אוויר על ידי צנטריפוגה.
7. עבור האכלה, להסיר את רוב המים מהאמבטיה פלסטיק המכיל תולעים (להשאיר ~ עומק 1 אינץ'). אמבט מערבולת להתרכז תולעים במרכזו של מיכל זה, פיפטה לערבב RNAi האכלה במעגל corralling תולעים. השתמש פיפטה להעביר בזהירות לשדל הנמלטים חזרה אל תערובת האכלה RNAi ללא מביך הסועדים האחרים!
8. לאחר האכלה (~ 1 שעה), לזהות planarians שהזינו היטב. תולעים אלו מראים גוון אדום עמוק מן RBCs ingested. בטל אחרים.
9. בזהירות להחליף האכלה פתרון עם מי מעיין טריים, מזעור ההפרעה למנוע egestion של מזון. כדי לעשות זאת, בעדינות למקם את התולעים לצד אחד של הצינור בעזרת פיפטה העברה, לשפוך מים עכורים, ובזהירות להחליף עם מים מתוקים זרמו במורד קיר מול האמבט. Planarians Resubmerge במהירות חשיפה ממושכת באוויר גם התוצאות egestion מזון.
10. Loosely seאל מכסה מיכל ולחזור בחממה (24 ° C)
11. חזור על פרוטוקול RNAi האכלה במשך מחזורים רבים (~ 2-3 ימים בנפרד), וביניהם מחזורי משובי [פרוטוקול מס '1] למסך של פנוטיפים RNAi. פרוטוקול סטנדרטי עבור הזנה והתחדשות יעיל גנים רבים מוצג באיור 2, אשר לוקח ~ 1 חודש משך מוחלט.

שינוי זה תוכנית עבור גנים שונים, כפרוטוקול האופטימלי יהיה תלוי בגורמים כמו יציבות mRNA, לוקליזציה רקמות, perdurance חלבון, או פיתוח של פנוטיפ אשר מונע מחזורים האכלה מרובים לאחר התחדשות. הערכת רמות מציאה פשוט על ידי סינון penetrance של הפנוטיפ (אם לכאורה), או על ידי גישות qPCR להשוות את רמות ה-mRNA ממוקד עם עוקבה בקרה שלילית.

4. נציג תוצאות:

שבר המטען assay התחדשות הוא חזק כל כך תולעים צריך להתחדש עם ("ראש אל זנב") קדמי, אחורי נורמלי קוטביות. זה יכול להיות הבקיע בהקדם חמישה ימים לאחר חיתוך, בהנחייתם של הופעתה של eyespots קדמית (asterixed, איור 1 א). עם זאת, שיקום של מבנים מורפולוגיים להשלים איבד מתרחשת לאחר שבוע אחד. מניפולציה תרופתי של התחדשות שבר המטען על ידי PZQ להניב שני ראשים תולעים (איור 1B) גם חזקים (EC ₅₀ = 87 (+ -) שברי דו קוטבית 11%, 70μM PZQ למשך 48 שעות ^20). Bipolarity מתרחשת על פני מחזור משובי יחיד. יעילות נמוכה של מבחני אלה סביר מתייחס בעיות מסיסות התרופה ו / או אחסון או שימוש מין התולעת השטוחה שונים שבהם PZQ אינו יעיל. עבור תרופות עם penetrance נמוך, מדד anteriorization משמש לעתים קרובות כדי להבקיע פנוטיפים ביניים מלבד ²² bipolarity להשלים. פנוטיפים הנובע RNAi של מבנים בקרה חיובית מוצגים איור 1: RNAi של Dugesia japonica שש 1 (ד j ושש-1) תוצאות פנוטיפ חסר עיניים ²³ (תרשים 1C), RNAi של Dugesia PC2 japonica (Dj-PC2) התוצאה היא הפסד של התגובה סלידה אור ²⁴ (איור 1D) ו RNAi של Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) תוצאות פנוטיפ שני ראשים ^{16-19, 21} מתוך רסיסי המטען (איור 1E). פנוטיפים אלו יכולה להיות מושגת באמצעות הבאה פשוט RNAi פרוטוקולים: Dj ושש-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), כאשר F = מחזור האכלה x = מחזור משובי בהתאמה.

איור 1:... שבר Trunk התחדשות assay שמאל, תמונה של planarian (למעלה) ו סכמטית (באמצע) כדי להראות מיקום המטען נכרת שבר ימינה, timecourse של התחדשות שבר המטען מראה מראה שבר התחדשות בזמנים המצוין (ימים) B תמונה של planarian שני ראשים המיוצר על ידי חשיפה PZQ. C תולעת "פרצוף ללא עיניים" המיוצר על ידי Dj ושש-1 RNAi. הפסד D התגובה סלידה אור תנועה Dj-PC2 RNAi תולעים (אדום מוכתם), לעומת תולעת לשלוט ניידים (מוכתם ירוק). E דו קוטבית planarian המיוצר על ידי Dj-βcatenin-1 RNAi. ב BE, סוף הקדמי המקורי של תולעים RNAi מכוונת שמאלה.

איור 2: רצף של האכלה חיתוך מחזורים בפרוטוקול RNAi טיפוסי הכולל ארוחות מרובות (F), מחזורי רגנרטיבית (x) כי הוא יעיל עבור מציאה של גנים רבים ד japonica. שינוי של פרוטוקול זה גנים בודדים עשוי להיות נחוץ כדי להניב תוצאות אופטימליות, למשל באמצעות פחות (בסוגריים) או מספר גדול יותר של האכלה מחזורי ההתחדשות.

Discussion

פרוטוקולים המתוארת כאן מבחני פרט ללימוד וטיפול התחדשות של Dugesia planarian japonica. הם פשוט אינם דורשים ציוד מיוחד כגון שהם יכולים להתבצע בקלות במעבדה או בכיתה. מבחני יכול להתבצע בנפרד, או בשילוב (להקרנה כימיים הגנטי של efficacies התרופה in vivo) והוא יכול להתבצע ברמת גן מועמד, או להתאמה ההקרנה, משוחדת תפוקה גבוהה יותר ^8. בין אם עבור מחקר על הביולוגיה של planarians מסקרן בזכות עצמם, או להערכת תפקוד vivo של homologues יונקים במודל חלופי ללימוד התחדשות רקמות, הגישות הללו יש אינטרס לזרז מתוך מגוון רחב של החוקרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב	מוכר	מספר קטלוגי	תגובות
מים חיים	Kandiyohi. Premium ווטרס בע"מ Minneapolis, MN	n / a	צורות אחרות של מי מעיינות לעבוד היטב גם. לראשונה מבחני הכדאיות משפט.
1 x שנאגרו מלחי Montjuïch: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mm), MgSO4 (1mm), MgCl2 (0.1mm), KCl (0.1mm), NaHCO3 (1.2 מ"מ), HEPES (1.5mm). pH 7.4 בשעה 24 ° C.	מספר ספקים	n / a	מים מלאכותית עבור טיפולים תרופתיים במהלך מבחני משובי כדי להבטיח חציצה pH. פתרון 5 / 8 של Holtfreter מהווה חלופה.
2xYT מרק	פישר סיינטיפיק	BP2467-500	מדיה = 31 גר '/ ליטר. Autoclaved.
צלחת פטרי (100x25mm)	פישר סיינטיפיק	08-757-11	שיכון תולעים במהלך מחזורי התחדשות
כיכר מהודרת (100x100x15mm)	פישר סיינטיפיק	08-757-11A	ממלאים במים, להקפיא עבור מגש קרח משמש משטח חיתוך תולעת
גיגית פלסטיק: n טוויסט סגירה "לוק (16oz).	קמעונאים שונים	n / a	מיכלי מים נוח חזק עבור קבוצות RNAi
כבד עוף	מסחרי מכולת	n / a	הטיה כלפי אספקה ​​אורגני, עקב הימנעות של אנטיביוטיקה.
בלנדר יד	כל ספק למטבח	n / a	השתמש להכנת פירה כבד עוף
1mm Wire Mesh מסננת	כל ספק למטבח	n / a	השתמש עבור מאמץ כבד עוף ופירה
שור דם תאים אדומים	Lampire מעבדות ביולוגיות	7240807	100% שטף ונקווה ההשעיה RBC
ניירות לסנן חוזר	Whatman # 3	1003 055
העברת פיפטה	פישר סיינטיפיק	13-711-41
סטרילי, להבים כירורגי	מספר ספקים	n / a
± Praziquantel	סיגמא אולדריץ	P4668	חנות aliquots אבקת בחושך ב 4 ° C. ליבש.
Dj ושש-1		GenBank AJ557022.1	RNAi בקרה חיובית פנוטיפ "עין פחות" 23
Dj-βcatenin-1		GenBank AB181913.1	RNAi בקרה חיובית פנוטיפ שני ראשים 17
Dj-PC2			RNAi בקרה חיובית עבור אובדן פנוטיפ סלידה אור 24