تجارب أداء مخصص ميكروأري MicroRNA

Summary

ووصف الإجراء بسيطة مخصصة لأداء التجارب ميكروأري microRNA. وتشمل الخطوات عزل الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبي العلامات المرجعية ، التهجين العينات الى ميكروأرس ، ميكروأرس مسح وقياس الاشارات التهجين.

Abstract

microRNAs (miRNAs) هي عائلة كبيرة من النيوكليوتيدات 22 ~ (الإقليم الشمالي) لفترة طويلة جزيئات الحمض النووي الريبي التي يتم التعبير عنها على نطاق واسع في حقيقيات النوى ^1. الجينوم المعقدة ترميز ما لا يقل عن مئات miRNAs ، التي تمنع في المقام الأول على التعبير عن عدد كبير من الجينات المستهدفة بعد transcriptionally ^{2 ، 3.} miRNAs تحكم طائفة واسعة من العمليات البيولوجية ^1. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبط تغيير التعبير ميرنا مع الأمراض التي تصيب الإنسان مثل أمراض السرطان وmiRNAs قد تكون بمثابة المؤشرات الحيوية للأمراض والتشخيص ^{4 ، 5.} من المهم ، لذلك ، لفهم التعبير وظائف miRNAs في ظل ظروف عديدة ومختلفة.

وقد استخدمت ثلاثة أساليب رئيسية للتعبير ميرنا ل : في الوقت الحقيقي PCR ، ميكروأري ، وتسلسل عميق. تقنية ميكروأري ميرنا وتتميز بأنها عالية الإنتاجية ، وعموما أقل تكلفة ، والأكثر من الخطوات التجريبية والتحليل يمكن كارالعبوات الناسفة في مختبر البيولوجيا الجزيئية في معظم الجامعات والمدارس والمستشفيات الطبية المرتبطة بها. هنا ، نحن تصف طريقة مخصصة لأداء التجارب ميكروأري ميرنا. ستتم طباعة مجموعة التحقيق ميرنا على الشرائح الزجاجية لإنتاج ميكروأرس ميرنا. يتم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام أسلوب أو كاشف يحافظ على الأنواع الصغيرة RNA ، وصفت بعد ذلك مع صبغة مضان. كعنصر تحكم ، وصفت أيضا الحمض النووي [أليغنوكليوتيد] إشارة المقابلة إلى مجموعة فرعية من miRNAs مع صبغة مضان مختلفة. والحمض النووي المرجعية خدمة للتدليل على نوعية الشريحة والتهجين وستستخدم أيضا للتطبيع البيانات. تختلط RNA والحمض النووي والمهجنة إلى شريحة تحتوي على ميكروأري تحقيقات لمعظم miRNAs في قاعدة البيانات. بعد الغسيل ، ويتم تفحص الشريحة للحصول على الصور ، وكميا كثافة من البقع الفردية. وسيتم تجهيز هذه الإشارات الخام وتحليلها وكذلك البيانات تعبيرا عن miRNAs المقابلة. Microaيمكن جرد الشرائح rray ومجدد للحد من تكلفة ميكروأرس وتعزيز اتساق التجارب ميكروأري. نفس المبادئ وإجراءات قابلة للتطبيق على أنواع أخرى من التجارب ميكروأري مخصص.

Protocol

1. طباعة ميكروأرس ميرنا مخصص

1. طباعة ميكروأري الشرائح باستخدام مرفق الخدمات الأساسية ميكروأري في جامعة أو شركة. جودة تصنيع ميكروأري هي واحدة من أهم العوامل الحاسمة لنجاح تجربة ميكروأري. حاول عدد قليل من الخدمات إذا كان ذلك ممكنا. من الناحية المثالية ، فإن المرء 5-10 طباعة الشرائح في وقت واحد ، وجميع الشرائح وسوف تبدو متطابقة مع البقع ، مفصولة تماما الفردية.
2. للحصول على دعم ميكروأري ، ونحن استخدام الثغرات الشرائح المغلفة الثاني.
3. تحقيقات عن ميرنا ، ونحن نستخدم NCODE متعددة الأنواع ميرنا ميكروأري دقق تعيين V2.
4. حل جميع [أليغنوكليوتيد] في محكمة أمن الدولة في 10 × 3 ميكرومتر وطباعة quadruply لهم على الشرائح. إصلاح الشرائح بواسطة الأشعة فوق البنفسجية وفقا لتعليمات للشرائح الثاني GAAPS. تسمية الشريحة مع قلم الماس للاحتفال المنطقة وجنب مع التحقيقات المطبوعة. تخزين حتى 22 درجة مئوية.

2. إعداد نموذج

1. أي وسيلةأو يمكن استخدامها لعزل الحمض النووي الريبي كاشف ، طالما أنه يحفظ الرناوات الصغيرة. ونحن عموما استخدام Trizol (Invitrogen) لاستخراج الحمض النووي الريبي مجموع ، مع كمية ونوعية مرضية الاستعدادات RNA ، كما يقاس بواسطة A _{260nm 280nm} وألف قراءات.
2. الحمض النووي الريبي لوضع العلامات ، ومزيج ~ 25 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع مع 0.5 ميكروغرام من 5' - PCU - DY547 - 3 ⁶ '× 1 في المخزن (HEPES 50 مم ، ودرجة الحموضة 7.8 و 20 ملي MgCl _{2 و} 10 ميكروغرام / مل BSA ، و 10 ٪ DMSO) التي تحتوي على 20 وحدة ~ T4 RNA يغاز 1 ، على أن تستكمل مع ~ DTT 10 مم و ~ 0،02-0،03 الحجم النهائي لل10 × العازلة RNA T4 1 يغاز لاعبي التنس المحترفين.
3. يسمح وضع العلامات على المضي قدما على الجليد داخل الثلاجة لمدة 2-24 ساعات. يعجل RNA مع 0.3 M خلات الصوديوم و 3 مجلدات من الايثانول. لربط كفاءة وهطول الأمطار ، ويحل الجيش الملكي النيبالي على مجموع أكثر من 2 ملغم / لتر ، والحفاظ على وحدة التخزين في ربط مجموع ميكرولتر 20 ~.
   1. إذا كانت أقل RNA هو متاح ، وكمية من الحمض النووي الريبي المدخلات و5' - PCU - DY547 - 3 "يمكن أن تخفض
   2. إذا كان الحمض النووي الريبي هو مخفف للغاية ، إضافة الناقل مثل الحمض الريبي النووي النقال الخميرة للمساعدة في هطول الأمطار.
4. والجمع بين التسمية في 1 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي [أليغنوكليوتيد] إشارة المقابلة إلى مجموعة فرعية من miRNAs الثدييات باستخدام Ulysis اليكسا فلور 647 وصفها كيت ⁶ الأحماض النووية باعتبارها مراقبة لعملية التهجين. تنقية الحمض النووي المسمى باستخدام عمود CentriSep وحفظها في الظلام على -20 درجة مئوية.

3. ميكروأري التهجين

1. لاستخدام الشرائح للمرة الأولى ، قبل هجن الشرائح في حل المصفاة SSC × 3 ، 0.1 ٪ SDS ، 0.2 ٪ لجيش صرب البوسنة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يغرق في الماء عدة مرات ، ثم في الأيزوبروبانول. تجفيف الشرائح باستخدام جهاز للطرد المركزي مع محول الشريحة في 100 غرام لمدة 5 دقائق الى 22 درجة مئوية.

ملاحظة : نحن نستخدم غرف كورنينج التهجين ميكروأري وmSeries إيري العلمية من Lifterslips لأداء ميكروأري التهجين.

2. شطف لىfterslips في الماء ، ثم في الإيثانول ، وذلك قبل التجفيف في الهواء. مكان شريحة داخل غرفة ميكروأري قاعدة التهجين ، وlifterslip على أعلى الشريحة. سيتم تغطية المنطقة lifterslip التحقيق مع شرائط بيضاء لها بالاتصال الشريحة.
3. في الظلام ، وتدور باستمرار على عجل ، المسمى الحمض النووي الريبي. يغسل مرة واحدة مع الايثانول 70 ٪ ، والهواء الجاف وبيليه. ينبغي أن يكون بيليه المحمر.
4. يعد حل التهجين التي تحتوي على 400 ملم نا ₂ هبو ₄ درجة الحموضة 7.0 ، 0.8 ٪ BSA ، و 5 ٪ SDS ، formamide 12 ٪ ⁶ مع 1/15-1/100 ميكرولتر من المنقى ، وصفت المرجعية الحمض النووي (2.4) لكل عينة الحمض النووي الريبي. كمية من الحمض النووي وأضاف المرجع يتوقف على مدى العديد من المسمى [أليغنوكليوتيد] مختلفة (2.4). إذا كان هناك أكثر من 100 ، ثم هناك حاجة أقل التخفيف.
5. حل جيد مع بيليه RNA ميكرولتر 60 ~ من الحل التهجين.
6. إضافة 20 ميكروليتر من الماء إلى كل من الآبار الرطوبة في قاعدة ميكروأري كورنينج غرفة التهجين.
7. إضافة رانه مزيج من الحمض النووي الريبي DNA ، وصفت الإشارة إلى الشريحة. استخدام طرف الماصة رقيقة ، وتلمس برفق على حافة lifterslip ، والسماح للحل لدخول الفضاء بين lifterslip والشريحة من خلال الشفط.
8. مكان الغرفة التهجين تغطي أكثر من قاعدة ، ثم ختم الغرفة مع مقاطع معدنية.
9. وضع غرفة كاملة داخل كيس من البلاستيك الذي يأتي مع الكاسيت الغرفة من كورنينج.
10. وضع كاسيت الغرفة (ق) داخل وعاء مع منشفة ورقية مرطبة ؛ تغطية الحاويات مع غلاف بلاستيكي ووضعه داخل 37 درجة مئوية الرطبة ، خلية ثقافة حاضنة لمدة 24 ساعة ~. هذه الاحتياطات (3.6 ، 3.9 ، 3.10) ضمان أن الحل التهجين لا تجف أثناء الحضانة.

4. بعد تجهيز التهجين

1. تفكيك الأشرطة غرفة واحدة تلو الأخرى. يغرق شريحة وlifterslip في محكمة أمن الدولة في 22 × 2 درجة مئوية. سوف lifterslip سقوط بطبيعة الحال خارج الشريحة. وضعه في SSC × 0.8. غسلالشرائح في SSC × 0.8 مرتين ، ثم ثلاث مرات في محكمة أمن الدولة س 0.4 و 1-2 دقيقة في المجموع. تجفيف الشرائح باستخدام جهاز للطرد المركزي مع محول الشريحة. يغسل بالماء وlifterslips إنقاذ لإعادة استخدامها في وقت لاحق.
2. مسح الشرائح مع أي جهاز ماسح ضوئي مناسبة ، على سبيل المثال ، إلمر بيركن ScanArray 5000 أو الجزيئي أجهزة الماسح الضوئي أكسون GenePix ميكروأري 4000B. تفحص في موجات قريبة إلى 547 نانومتر ونانومتر 647 للحصول على ملفات الصور ذات الصلة.
3. استخدام برامج مثل BlueFuse لقياس كثافة بكسل في المدخلات ، وملفات الصور من 4.2). تفقد المواقع الفردية مع برنامج لاستبعاد بقع غير طبيعية على ميكروأرس لمزيد من الدراسة. هذه البقع عادة ما تكون غير طبيعية تنشأ من سوء الطباعة الشريحة أو الشرائح المناولة بعد التهجين.
4. استخدام برامج مثل GeneSpring و Excel لتحليل البيانات وعرضها. الاعتبارات العامة لتطبيع البيانات ميكروأري تطبيق ، وهي خارج نطاق هذه الورقة.
5. مرة واحدة ويتم الحصول على إشارات مرضية AFثالثا 4.3) ، الشريط الشرائح ميكروأري لإعادة استخدامها ^7. شطف الشرائح في الماء ، ثم تزج في مرحلة ما قبل حرارة ، هيدروكسيد الصوديوم 1 مم و 0.1 x في محكمة أمن الدولة طبق تلطيخ عند 62 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة. كرر الحضانة مرة واحدة. غسل جيم الشرائح عدة مرات في الماء لمدة تصل إلى 60 دقيقة مع اهتزاز لطيف في 22 درجة تجفيف الشرائح باستخدام جهاز للطرد المركزي ، وتخزين حتى 22 درجة مئوية.
6. لاستخدام الشرائح مجدد ، فإنه ليس من الضروري قبل هجن إليها مرة أخرى. ببساطة تغسل في ماء تليها الأيزوبروبانول ، والجافة الشرائح الحق قبل التهجين.

5. ممثل النتائج :

لدينا إلى حد كبير مع الإجراءات المذكورة إلى المكانة العالمية في التعبير ميرنا الآلاف من العينات ، أي الرنا المعزولة من الزرد لعينة الإنسان في ظل ظروف عديدة ومختلفة. يوضح الشكل 1 صورة ممسوحة ضوئيا لميكروأري لإظهار إشارات التهجين دقيقة جدا وقوية على الشريحة. وبيرسون correlatiعلى معاملات بين التقنية يعيد التهجين ميكروأري ~ هي 0.99 ⁷ ، مشيرا إلى استنساخ ممتازة.

الشكل 1 صورة مركب شريحة ميرنا ميكروأري فحصها بعد التهجين. أدى ظهور بقع حمراء من التهجين بواسطة الحمض النووي المرجعية ، البقع الخضراء من عينة الحمض النووي الريبي DY547 المسمى ، في حين أن البقع الصفراء التي كانت من التهجين الحمض النووي الريبي على حد سواء وعلى نفس التحقيقات.

Discussion

فعلى الرغم من التطورات الأخيرة في تقنيات التسلسل عميق ، ميكروأري يظل خيارا صالحا لتحليل إنتاجية عالية من الحمض النووي والحمض النووي الريبي. مقارنة تسلسل عميق ، والتجارب ميكروأري أرخص ، ومختبر البيولوجيا الجزيئية نموذجية يمكن تنفيذ معظم التجارب وتحليل البيانات في ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
البنود	بائع	فهرس العدد	تعليقات
NCODE متعددة الأنواع ميرنا ميكروأري دقق تعيين V2	Invitrogen	MIRMPS201	مصممة على أساس النسخة 9.0 miRBase (أكتوبر 2006). ~ أنه يحتوي على 1140 معدلة ، 34-44 [أليغنوكليوتيد] تحقيقات دامت NT ليطير ، ودودة ، الزرد ، الفأر ، الجرذ ، وmiRNAs الإنسان ، وعدد من تحقيقات الرقابة الداخلية مثل snoRNAs. تحقيقات ميرنا وdoublets من متواليات مكملة لmiRNAs ناضجة ، وبالتالي حجم 44 ~ NT. للتحليل يمكن للمرء أن التركيز على miRNAs من جينوم معين (ق) من الفائدة.
Trizol	Invitrogen	15596018	لدينا أيضا استخدام اليورانيوم المخصب وجزء صغير الحمض النووي الريبي لوصفها ، على الرغم من مجموع عينات الحمض النووي الريبي هي أسرع وأسهل لإعداد وتقدير إلى ومناسبة لتطبيقات مثل التحليل المصب مرنا.
T4 RNA يغاز 1	نيو انغلاند بيولأبس	M0204L
Ulysis اليكسا فلور 647 الأحماض النووية وصفها كيت	Invitrogen	U21660	ويمكن استخدام هذه المجموعة أو منتجات مشابهة لعينات الحمض النووي الريبي تسمية التجريبية أو RNA التحكم (بدلا من الحمض النووي السيطرة) كذلك.
5' - PCU - DY547 - 3 '	Dharmacon	أدلى مخصص	يمكن أن تكون صغيرة الحمض النووي الريبي مماثل بواسطة الكسر المسمى الربط.
أعمدة CentriSep	فصل برينستون	CS - 901
GAPSII الشرائح المغلفة	كورنينج	40004	قد تكون أنواع أخرى من الشرائح المستخدمة أيضا.
غرف ميكروأري التهجين	كورنينج	2551 أو 40080	وينبغي أن أنواع أخرى من غرف coverslips التهجين والعمل أيضا. ويمكن استخدام آلات التهجين المتاحة تجاريا التهجين تقليل الوقت إلى حد كبير ، على سبيل المثال ، إلى ساعات 2 ~.
Lifterslips	الermo / إيري العلمية	25X60I - M5439 - 001 - LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	اجيلنت