Выполнение пользовательских Эксперименты Microarray микроРНК

Резюме

Простая процедура выполнения пользовательских экспериментов микрочипов микроРНК описывается. Шаги включают в себя выделения РНК, РНК и маркировки ссылкой ДНК гибридизации образцы микрочипов, сканирования микрочипов, количественной оценки и анализа гибридизации сигналов.

Аннотация

микроРНК (миРНК) являются большой семье ~ 22 нуклеотидов (нт) длинные молекулы РНК, которые широко выражено у эукариот ^1. Комплекс генома кодируют по меньшей мере сотни микроРНК, которые в первую очередь ингибирует экспрессию большого числа генов-мишеней после транскрипционно ^{2, 3.} микроРНК контроль широкий спектр биологических процессов ^1. Кроме того, изменения выражения микроРНК была связана с человеческими болезнями, такими как рак, и микро-РНК могут служить в качестве биомаркеров заболеваний и прогноз ^{4, 5.} Важно, таким образом, чтобы понять выражения и функции микроРНК под различными условиями.

Три основные подходы были использованы в профиль микроРНК выражение: ПЦР в реальном времени, микрочипов, и глубокие секвенирования. Техника микроРНК микрочипов имеет преимущество в том, высокую пропускную способность, как правило, менее дорогие, и большинство экспериментальных и анализ шаги могут быть Каррсамодельное взрывное устройство в лаборатории молекулярной биологии в большинстве университетов, медицинских школ и связанные с ними больницы. Здесь мы опишем метод для выполнения пользовательских экспериментов микрочипов микроРНК. Набор микроРНК зонд будет напечатан на предметные стекла для производства микрочипов микроРНК. РНК выделяли с использованием метода или реагент, который сохраняет мелкие виды РНК, а затем помечены флуоресцентным красителем. В качестве контроля ссылкой ДНК олигонуклеотидов соответствующее подмножество микроРНК также помечены различными флуоресценции красителя. Ссылка ДНК будет служить, чтобы продемонстрировать качество слайдов и гибридизации, а также будут использованы для нормализации данных. РНК и ДНК смешивают и гибридизации с микрочипов слайд, содержащий зонды для большинства из микроРНК в базе данных. После мытья слайд сканируется для получения изображения, и интенсивности отдельных пятен количественно. Эти сигналы сырья будут дополнительно обработаны и проанализированы как выражение данные соответствующего микроРНК. МкАrray слайды могут быть удалены и регенерируется снизить стоимость микрочипов и повысить согласованность микрочипов экспериментов. Те же самые принципы и процедуры применимы к другим типам пользовательских экспериментов микрочипов.

протокол

1. Печать пользовательских микрочипов микроРНК

1. Печать микрочипов слайды использованием микрочипов основные услуги объекте в университете или компании. Качество изготовления микрочипов является одним из важнейших факторов для успеха эксперимента микрочипов. Попробуйте несколько услуг, если это возможно. В идеале следовало бы напечатать 50-100 слайдов за раз, и все слайды будут выглядеть одинаково, с хорошо разделены, отдельные пятна.
2. Для поддержки микрочипов, мы используем ПРОБЕЛЫ II покрытием слайды.
3. Для микроРНК зондов, мы используем NCode нескольких видов микроРНК Microarray Зонд Установить V2.
4. Растворите все олигонуклеотидов в 3 х SSC при 10 мкМ и четырежды распечатать их на слайдах. Fix слайды ультрафиолетового облучения в соответствии с инструкциями для GAAPS слайды II. Этикетка слайд с пером алмаз, чтобы отметить области, и на стороне печатной зондов. Хранить при температуре 22 ° C.

2. Пробоподготовка

1. Любой методили реагент может быть использован для выделения РНК тех пор, пока она сохраняет малых РНК. Мы обычно используем Trizol (Invitrogen) для извлечения полной РНК, с удовлетворительными количество и качество препаратов РНК, если судить по _260nm и _{280 нм} чтениях.
2. Для РНК маркировки, смешайте ~ 25 мкг общей РНК с 0,5 мкг 5'-PCU-DY547-3 ^"6 в 1 х буфера (50 мМ HEPES, рН 7,8, 20 мМ MgCl _2, 10 мкг / мл BSA, 10% ДМСО), содержащий ~ 20 единиц Т4 РНК-лигазы 1, дополненные ~ 10 мМ DTT и ~ 0,02-0,03 конечного объема 10 х Т4 РНК-лигазы 1 буфер для АТФ.
3. Разрешить маркировки действовать на лед в холодильнике в течение 2-24 часов. Осадок РНК с 0,3 М ацетата натрия и 3 объема этанола. Для эффективного лигирования и осадков, растворяются в общей РНК более 2 мг / мл, и сохранить общий объем лигирования при ~ 20 мкл.
   1. Если меньше РНК имеется, количество входных РНК и 5'-PCU-DY547-3 "может быть сокращена.
   2. Если РНК очень разбавленных, добавить носитель, такой как дрожжевой тРНК, чтобы помочь в осадках.
4. Комбинат и этикетки в общей сложности 1 мкг ДНК ссылкой олигонуклеотидов соответствующие подмножества млекопитающих микроРНК использованием Ulysis Alexa Fluor 647 нуклеиновых кислот Kit Маркировка ^6, как управление для гибридизации процесса. Purify меченых ДНК с использованием CentriSep колонки и сохранить в темноте при температуре -20 ° С.

3. Microarray гибридизации

1. Чтобы использовать слайды в первый раз, предварительно гибридизации слайды в отфильтрованный раствор 3 х SSC, 0,1% SDS, 0,2% BSA в течение 30-60 минут при температуре 37 ° C. Погрузите их в воду несколько раз, то в изопропанола. Сухой слайды использованием центрифуги с слайд адаптера на 100 г в течение 5 мин при 22 ° C.

Примечание: Мы используем Corning микрочипов гибридизации камер и mSeries Эри Научно о Lifterslips выполнять микрочипов гибридизации.

2. Промыть лиfterslips в воде, затем в этаноле, перед сушкой на воздухе. Место слайд внутри камеры базы гибридизация микрочипов, и lifterslip в верхней части слайда. Lifterslip покроет площадь зонда, с белыми полосами связавшись слайда.
3. В темные, спина вниз осаждаются, меченой РНК. Вымойте это когда-то с 70% этанола, и воздух сухой осадок. Гранулы должны быть красноватые.
4. Подготовка гибридизации раствора, содержащего 400 мМ Na ₂ HPO ₄ рН 7,0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% формамида ⁶ с 1/15-1/100 мкл очищенной, обозначенные ссылкой ДНК (2,4) на пробу РНК. Количество добавленного ссылкой ДНК зависит от того, сколько различных олигонуклеотидов помечены (2,4). Если Есть более чем 100, то меньше разбавления не требуется.
5. Растворите гранулы РНК хорошо с ~ 60 мкл гибридизации решение.
6. Добавьте 20 мкл воды к каждому из увлажнение скважин в гибридизации Corning база камеры микрочипов.
7. Добавить тОн смесь меченых РНК и ДНК ссылкой на слайд. Использование тонкого кончика пипетки, аккуратно прикоснуться к краю lifterslip, и позволяют решение войти в пространство между lifterslip и слайд через всасывания.
8. Место гибридизации камеры крышку над базой, то уплотнение камеры с металлическими зажимами.
9. Положите все камеры внутри пластиковый пакет, который поставляется с камерой кассету из Corning.
10. Место камеры кассету (ы) внутри контейнера с смачивается бумажным полотенцем; крышка контейнера с полиэтиленовой пленкой и поместите его в 37 ° C влажной, культура клеток инкубаторе в течение ~ 24 часов. Эти меры предосторожности (3.6, 3.9, 3.10) обеспечить, чтобы гибридизация решение не высыхает во время инкубации.

4. После гибридизации обработки

1. Разберите камеру кассет по одному. Погрузите слайд и его lifterslip в 2-х SSC при 22 ° C. Lifterslip естественно падать слайда. Поместите его в 0,8 х SSC. Мытьслайды в 0,8 х SSC два раза, затем три раза в 0,4 х SSC, 1-2 мин в общей сложности. Сухой слайды использованием центрифуги с слайд адаптером. Вымойте lifterslips с водой и сохранить для повторного использования в последующем.
2. Сканирование слайдов с любым подходящим сканером, например, Perkin Elmer ScanArray 5000 или Molecular Devices Axon GenePix 4000B микрочипов сканера. Проверка при длинах волн, близких к 547 нм и 647 нм для получения соответствующих файлов изображений.
3. Использование таких программ, как BlueFuse количественно интенсивности пикселов на входе, файлы изображений из 4.2). Осмотрите отдельных пятен с программой, чтобы исключить ненормальных пятен на микрочипы из дальнейшего рассмотрения. Эти аномальные пятна обычно возникают из бедных печать слайдов или слайд-обработки после гибридизации.
4. Использование таких программ, как GeneSpring и Excel для анализа данных и представления данных. Общие соображения для нормализации микрочипов данные относятся, которая выходит за рамки данной статьи.
5. После удовлетворительного сигналы получаются афтер 4,3), стрип-микрочипов слайды для повторного использования ^7. Промыть слайды в воде, затем погрузите в подогретого, 1 мМ NaOH и 0,1 х SSC в сосуд для окрашивания на 62 ° С в течение 10-20 минут. Повторите инкубации один раз. Вымойте слайды несколько раз в воде в течение до 60 минут с осторожном встряхивании при 22 ° C. Сухой слайды использованием центрифуг, и храните при температуре 22 ° C.
6. Для использования регенерированного слайды, не стоит предварительно скрещивать их снова. Просто промыть их в воде следует изопропанол, и сухие слайды прямо перед гибридизации.

5. Представитель Результаты:

У нас в основном соответствует описанной процедуры в профиль глобальной выражение микроРНК в тысячах образцов, т. е. РНК изолирован от данио рерио, чтобы человеческий образец под различными условиями. На рисунке 1 показано отсканированное изображение микрочипов, чтобы продемонстрировать очень точные и сильные сигналы гибридизации на слайда. Пирсон correlatiо коэффициентах между техническими повторов микрочипов гибридизации ~ 0,99 ^7, что указывает на отличную воспроизводимость.

Рисунок 1 композитный образ отсканированного слайда микрочипов микроРНК после гибридизации. Красные пятна в результате гибридизации ссылкой ДНК, зеленые пятна от DY547 меченных образцов РНК, в то время как желтые пятна были от гибридизации как ДНК и РНК, к тому же зондов.

Обсуждение

Несмотря на последние достижения в области технологий глубокой последовательности, микрочипов остается жизнеспособным выбором для высокопроизводительного анализа ДНК и РНК. По сравнению с глубоким последовательности, микрочипов эксперименты дешевле, а типичные лаборатории молеку?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Элементы	Продавец	Номер по каталогу	Комментарии
NCode нескольких видов микроРНК Microarray Зонд Установить V2	Invitrogen	MIRMPS201	Разработанный на основе miRBase выпуска 9.0 (октябрь 2006). Он содержит ~ 1140 без изменений, 34-44 нт долго олигонуклеотидов в качестве зондов для червя, летать, данио, мыши, крысы и человека микро-РНК, и ряд внутренних зондов контроля, таких как snoRNAs. МикроРНК зонды дублетов последовательности дополняют зрелые микроРНК, следовательно, размер ~ 44 NT. Для анализа можно сосредоточиться на микроРНК от конкретного генома (ов), представляющих интерес.
Trizol	Invitrogen	15596018	Мы также использовали обогащается, небольшая часть РНК для маркировки, хотя общая образцов РНК быстрее и проще в приготовлении и количественно и подходит для последующих приложений, таких как мРНК анализа.
Т4 РНК-лигазы 1	Новая Англия Biolабс	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 нуклеиновых кислот Kit маркировки	Invitrogen	U21660	Этот комплект или аналогичные продукты могут быть использованы для обозначения экспериментальных образцов РНК или РНК контроля (вместо контроля ДНК), а также.
5'-PCU-DY547-3 '	Dharmacon	На заказ	Мелкая фракция РНК может быть так же помечены труб.
CentriSep столбцов	Принстон Цветоделение	CS-901
GAPSII покрытием слайдов	Гранулирование	40004	Другие типы слайды могут быть использованы.
Камеры Microarray гибридизации	Гранулирование	2551 или 40080	Другие виды гибридизации камер и покровные также должны работать. Использование имеющихся в продаже машин гибридизация может уменьшить гибридизации время существенно, например, до ~ 2 часа.
Lifterslips	ThErmo / Эри Научные	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent