المقررة الإنتشار الأفقي والإيماس من غشاء بروتينات في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الاسترداد الإسفار وPhotobleaching الإسفار الخسارة

Summary

هذا التقرير وصفا للاستخدام التصوير الخلية الحية وتقنيات photobleach لتحديد التعبير السطح، ومسارات النقل وحركية الاتجار خارجيا أعرب GFP الموسومة درجة الحموضة حساسة، والبروتينات في الغشاء البلازمي للخلايا العصبية.

Abstract

Protocol

1. الثقافة الخلية، تنبيغ الفيروسية، وبروتين تعبير

1. الخلايا العصبية ثقافة عالية الكثافة قرن آمون من الفئران الوليدة الجنينية يوم 18 (E18) على زجاج coverslips بولي-L-يسين المغلفة لل14-25 أيام في المختبر (DIV).
2. 6 24hrs قبل التجارب الحية، وخلايا transduce مع فيروس سندبيس الموهن الذي يحتوي على بروتين غشاء من الفائدة، والموسومة مع pHluorin فائقة مسير الشمس (سبتمبر).
3. إضافة المتوسطة pseudovirion المحتوية مباشرة إلى ساترة 1mL تحتوي على وسائل الإعلام مكيفة، وعاد إلى حاضنة الثقافة. سوف عيار والوقت للتعبير البروتين الفيروسي بعد تنبيغ تختلف تبعا للدفعة الفيروس وينبغي أن تحدد لكل دفعة قبل بدء التجارب الخلية الحية.

2. FRAP-FLIP التصوير الخلية الحية

1. معدات مجموعة المتابعة
   1. نقل ساترة لغرفة التصوير من مجهر زايس LSM Axiovert META 510 مبائر.للحد من تقلبات أسعار الطاقة أثناء التصوير، وتأكد من أنه تم تشغيل المجهر على، مع انتاج الليزر 100٪، ما لا يقل عن 20 دقيقة قبل التصوير.
   2. على الفور، تحل محل الثقافة المتوسطة مع مرحلة ما قبل حرارة (37 درجة مئوية) حل خارج الخلية التي تحتوي على تسجيل 140 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 15 جلوكوز مم، 1.5 مم CaCl _2، 1.5 ملم MgCl _2، 20-25 HEPES مم (درجة الحموضة تعديلها ل 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم)، ووضع حجرة في مرحلة ما قبل الساخنة (37 درجة مئوية) من Axiovert زايس.
      
      ضمان يتم ضبط الأسمولية من الحل خارج الخلية إلى تسجيل في غضون 10 mOsM متوسطة ثقافتك. لم يقدم تبخر كبيرة تحدث أثناء timecourse من التجربة، هذا CO ₂ حل مستقل هو مناسبة لتجارب قصيرة (<10 ساعة). المكمل 1-2 ملم مع بيكربونات الصوديوم ويوصى.
2. تحديد بارامترات التقاط التصوير
   1. الأول، تحديد الخلايا العصبية معربا عن المؤيد المؤتلفالبروتين من الاهتمام وجعلها التركيز.
   2. مع زيت 63X اعترض، والحصول على صورة للخلية كاملة باستخدام 488nm إثارة ضوء الليزر على قوة الليزر منخفض. لتقليل photobleaching، واستخدام السرعة الاسمية (7-9)، وانخفاض بيكسل (512-512) حفظ مجموع سرعة مسح <1 2.
   3. تحديد جزء من التغصنات إلى وتصغير الصورة للقبض على الإطار الذي يحتوي على العائد على الاستثمار (~ 1،5-2،5 × زوم بصري). حيثما كان ذلك ممكنا، وضمان مجال الرؤية يحتوي على العديد من العمليات بحيث يمكن الحصول على قياسات من التشعبات المرجعية، لتحديد ما إذا كان غير محدد photobleaching نظرا لحدوث والاستحواذ.
   4. ضبط الفلاتر وذات الثقب، وزيادة سرعة المسح الضوئي للكشف عن لتمكين مضان القصوى من الإثارة ليزر ولكن مع الحد الأدنى من الإشباع محدودة. ويوصى قطره الثقب كبير، لتحقيق أقصى قدر جمع الفوتون (2μm هو مناسبة لالعمود الفقري والتشعبات الثلاثي). وينبغي أن المكسب كاشف تكون قوية بما يكفي للكشف عن زيادات مضان صغير،ان هذه الصور الأولى للغاية، وذلك قبل photobleaching لا تجاوز 10٪ من بكسل المشبعة.
   5. حفظ هذا التكوين لاستخدامها في مرحلة ما قبل / ما بعد التبييض ومراحل الانتعاش من التجربة.
   6. تحديد المقبل في المناطق photobleach؛ اختيار ROI لphotobleach الأولية والمناطق المحيطة في المرحلة photobleaching المتكررة لاحقة. ضمان المناطق المحيطة واسعة بما يكفي لمنع الانتعاش عن طريق الانتشار بين المسح (عادة 5 ميكرون، انظر الشكل 2).
   7. ضبط معلمات لتبييض رويس photobleach على حد سواء. يجب أن يكون سريعا photobleach الأولي (0،1-0،5 ثانية) التي تتطلب ما بين 1-5 مرات التكرار، اعتمادا على زووم بصري وحجم العائد على الاستثمار. بالنسبة للمناطق المحيطة، ينبغي تعديل إثارة ليزر لضمان photobleaching المستمر للمناطق المحيطة، ولكن من دون ضرر الضوئية.
   8. كمبدأ توجيهي، ونحن نستخدم 100٪ الإثارة ليزر لphotobleach الأولي، و 10٪ للدرجة الحموضة المتكررة photobleachingبورصة عمان.
3. صورة اكتساب
   1. مرة واحدة وقد تم تعيين كافة المعلمات، تنفيذ تجربة FRAP-FLIP كتسلسل متغير صورة مرور الزمن، الواردة في كتل 4 أدناه:
      
      بلوك 1: 3-10 الصور الأساس قبل التبييض، وعلى قوة الليزر منخفض، أي تأخير وقت
      بلوك 2: Photobleach العائد على الاستثمار في الطاقة المركزية ليزر كامل، 1-5 التكرار
      بلوك 3: 3-10 الصور الانتعاش بعد التبييض
      بلوك 4: photobleach المتكرر من المناطق المحيطة في قوة الليزر متوسطة مع التقاط الصور في فترة زمنية نموذجي من 1 - 5 ثوان، اعتمادا على معدل الاسترداد من البروتين قيد التحقيق.
   2. أخيرا، حل محل تسجيل خارج الخلية مع حل تسجيل مخزنة في pH6 التي تحتوي على كلوريد الصوديوم 140 ملم، 5 ملم بوكل، خفض 15mm الجلوكوز، 1.5 ملم CaCl _2، 1.5 ملم MgCl _2، 20-25 مم زارة التربية والعلم (لإرواء مضان) أو تستكمل مع 50 ملي NH4Cl التي تحتوي على كلوريد الصوديوم 90 ملم، 5 ملم بوكل، 15 جلوكوز مم، 1.8 ملي CaCl _2، 0.8 ممMgCl _2، 20-25 HEPES مم، pH7.4 (للكشف عن البروتينات في مخازن انخفاض الرقم الهيدروجيني بين الخلايا)، (انظر الشكل 2).
   3. جمع ما لا يقل عن 10 حتي 20 مجموعات من البيانات عن كل بروتين المؤتلف، لتمكين التحليل الإحصائي. جرى الابقاء على ظروف التصوير لتجنب النتائج التحيز، وضمان اتساق عبر مكررات. تجاهل أي مجموعات البيانات حيث لوحظ ناقصة، كبيرة تبيض الانحراف البؤري أو تلف الخلايا الضوئية.

3. تحليل البيانات

1. فتح الصور مع برنامج يماغيج.
2. محاذاة مداخن لمراعاة تقلبات صغيرة في طائرة س ص قد تكون وقعت في جميع أنحاء السلسلة الزمنية باستخدام البرنامج المساعد Stackreg (المحمول → → stackreg التحول: هيئة جامدة → ).
3. بالنسبة للصور التي اتخذت بشأن مبائر زييس، واستخدام أدوات LSM المساعد للإبلاغ عن قيم الوقت كملف نصي (المحمول → LSM أدوات → عرض LSM أدوات → → )،واستيراد هذه القيم في جدول بيانات تحليل.
4. لقياس تقلبات مضان خلال التجربة FRAP-FLIP، تقسيم قطعة photobleached إلى مناطق بكسل الفردية (~ 20pixels) وقياس مضان متوسط ​​هذه رويس في كل مرة نقطة (F). للحصول على هذه القيم بشكل سريع، حدد رويس متعددة باستخدام أداة يماغيج 'دوروا مدير "تحليل (تحليل أدوات → → مدير ROI) وتقديم تقرير عن مضان يعني لكل بكسل باستخدام' مؤامرة Z-محور الملف 'الأمر (صورة → → الأكوام مؤامرة Z المحور الشخصي).
5. كرر هذه الخطوة لقياس كثافة مضان من المنطقة الخلفية، فلوري غير.
6. تطبيع كثافة مضان في كل نقطة مرة من خلال طرح القيم الأساسية لإزالة الضوضاء التجريبية، وتقسيم كل القيم من قبل هذا الاجراء يعني خط الأساس قبل المبيض.
7. قياس كثافة مضان من التشعبات غير photobleached المجاورة لتقييم مستوى معين غيرphotobleaching خلال اكتساب. تم تخيف تصحيح لغير محدد photobleaching لتفسير البيانات 'FRAP-FLIP' وينبغي تجنبها كلما أمكن ذلك.
8. لحساب إذا انتعاشا كبيرا قد حدث في عائدات الاستثمار، وطرح الوسط من التدابير 5-10 الأخيرة من تسلسل من الوسط التدابير 5-10 الأول (ΔF) وتحديد الدلالة الإحصائية. تصنيف رويس يتعافى وعدم تعافيه، لتقييم نمط الإيماس (النقاط الساخنة الإيماس أي انتعاش أو العمود الفقري رمح مباراة).

4. ممثل النتائج

يتم عرض نتائج تجربة FRAP-FLIP نموذجي في الشكل. 2. هنا، وقد تم التعبير عن الخلية العصبية الوحيدات GluA2 من نوع أمبا مستقبلات الغلوتامات، الموسومة ب سبتمبر photobleached بشكل انتقائي على طول منطقة التغصنات. التين 2.A يوضح منطقة التغصنات التي تم تصويرها، ويشير إلى رويس التي تم اختيارها لphotobleaching (المناطق مربع أبيض). التم تبييض ه كبير منطقة محاصر أبيض مرة واحدة، تليها المتكررة تبييض المناطق المحيطة محاصر، وأبرز الأسهم مع ضعف الزرقاء برئاسة. السهم الأحمر يشير إلى قياس العائد على الاستثمار، كما هو موضح في تضخم مرتفع في الجزء الأسفل من اللوحات.

التين 2.B، ويبين كثافة مضان في قياس العائد على الاستثمار على مدار الساعة من التجربة. في هذا المثال، تم تسجيل فترة نقاهة بعد دقيقة واحدة من photobleach الأولي للسماح للمستقبلات غير مقصور للدخول في العائد على الاستثمار عن طريق الانتشار الأفقي. عندما يتم photobleached المناطق المحيطة، والمغطي للإشارة مضان من هذا جزء متحرك للغاية من المستقبلات من المنطقة الوسطى، وتضعف الدول الواقعة في منطقة خارج. وبالتالي، يمكن للزيادة في مضان (ΔF): لاحظت خلال تسلسل "FLIP" يمكن أن يعزى إلى إدراج SEP-GluA2 في رمح شجيري. غسل انخفاض الرقم الهيدروجيني ودرجة الحموضة 7.4 + إضافة NH4Cl تأكيد على التوالي التي مشتق من مضان تقاس من السطحالبروتينات والكشف عن نسبة من البروتينات، والخلايا المعزولة داخل ROI قياسها.

وعلى النقيض من FRAP، هذه المنهجية يعزل الانتعاش بسبب الإيماس، مما أدى إلى انخفاض كبير في مستوى من الانتعاش مضان في المنطقة photobleached. حتى الآن لا يوجد نموذج رياضي يمكن الاعتماد عليها وقد وضعت لتناسب وتحليل اثار سجلت استرداد باستخدام هذا الأسلوب الانتقائي التبييض. غير أنه من الممكن احتواء أثر الانتعاش مع انتعاش أحادية الأسي:

F _(T) = A _S - A ه ₀ ^{(-T / τ)}

حيث F _(T) هو مضان في الزمن t، _ليالي هو ثابت قيمة الدولة، ₀ هو تعويض في وقت 0، τ هي المرة ثابت. يتم إصلاح انتعاش النمو مع معدل معين للتوصل الى توازن، المقابلة لحالة مستقرة بين الإدراج ونشرها. الأهم من ذلك، استخراج ثابت وقت من هذا 1nalysis لا يعكس في الوقت ثابت من الإيماس ويمكن أن تستخدم إلا لعلاج النسبية للحصول على البروتين الفردية.

وعلاوة على ذلك، فإن نمط من المتوقع انتعاش مضان من المرجح أن لوحظ في المجالات الفرعية على طول المنطقة photobleached. قد تحليل ROI صغيرة داخل شريحة photobleached سيكون ضروريا للكشف عن الإيماس "النقاط الساخنة" ويستحسن أن نحلل مناطق أطوال مماثلة كما تباين كثافة من هذه البقع بين التغصنات سوف تؤثر على معدل محسوب.

يتبع الشكل 3 يبين امتدادا لهذا البروتوكول، وتطبيق photobleach إلى ROI قسم كبير مع التشعبات المتعددة في مجال الرؤية، من خلال تكرار انتقائي تبييض التغصنات واحد فقط. هذا النهج يمكن التقليدية 'FRAP "وبيانات" FRAP-FLIP' التي سيتم الحصول عليها في نفس الوقت. في هذا المثال، لقد تم تشخيص الخلايا العصبية قرن آمون مع وحدة فرعية مستقبلات الغلوتامات من الطبقة kainate؛ سبتمبر الموسومة GluK2. PRIOص إلى التصوير، وكانت الخلايا العصبية لمعاملة هؤلاء مع cylcohexamide (2hrs في 200μg/ml)، لمنع تصنيع البروتين. على هذا النحو، والانتعاش مضان في رويس منها قياس (الشكل 3.B) يكشف عن نسبة الشفاء بسبب انتشار الأفقي وإعادة التدوير في التغصنات FRAP قياسي مقابل إعادة التدوير وحدها في التغصنات التعرض للبروتوكول "FRAP-FLIP '. ويمكن مقارنة القيم ΔF من المنحنيات في مقابل استرداد FRAP 'FRAP-FLIP'، المساهمات النسبية لإعادة التدوير (ΔF _تفصيل = 11.05٪) مقابل نشر الجانبي (ΔF _فرق = 9.35٪) يمكن الاستدلال. على عكس الشكل 2، فإن الانتعاش لا الحفاظ على مستوى ثابت، بل دولة، ونظرا لتثبيط تخليق البروتين، ويظهر زيادة عابرة واللاحقة الانزال في إشارة، المقابلة لاستنفاد تجمع مستقبلات المتاحة (انخفاض حوالي 20٪ ولاحظ خلال فترة تسجيل).

الشكل 1. تخطيطي لمديري المدارس من البروتوكولات FRAP FRAP-FLIP مقابل هذا تخطيطي يوضح نتائج لFRAP العادية مقابل بروتوكول 'FRAP-FLIP "، وذلك باستخدام سبتمبر الموسومة المستقبلات. ويظهر انتعاش مضان في FRAP التقليدي على الجانب الأيسر. ويرجع انتعاش مضان قياس العائد على الاستثمار في وسط لمزيج من المستقبلات نشر الجانبية غير photobleached و سبتمبر الموسومة من خارج ROI photobleached والإدراج من المستقبلات من خلال إعادة تدوير و / أو دي نوفو الإيماس إلى رمح شجيري. على النقيض من ذلك، فإن photobleached المتكررة للرويس المرافقة هو موضح في الجانب الأيمن، ويبين كيف يمكن لهذا التغيير "FRAP-FLIP 'استرداد الصمت بروتوكول بسبب نشر الجانبي. على هذا النحو، يمكن أن يعزى أي انتعاش مضان محسوبة على الإدراج مباشرة في العائد على الاستثمار.

الشكل 2.ادراج SEP-GluA2 في غشاء البلازما على رمح شجيري

أ) الخلايا العصبية الحصين معربا عن SEP-GluA2، photobleached بشكل انتقائي على طول منطقة التغصنات. التخطيطي يوضح منطقة التغصنات التي تم تصويرها، في حين أن أعلى لوحة اليد اليسرى يسلط الضوء على رويس التي تم اختيارها لphotobleaching. وكان ابيض وكبير منطقة محاصر أبيض مرة واحدة، تليها المتكررة تبييض المناطق المحيطة محاصر، وأبرز الأسهم مع ضعف الزرقاء برئاسة. هذه اللوحة تظهر التغصنات قبل photobleaching. السهم الأحمر يشير إلى قياس العائد على الاستثمار، كما هو موضح في تضخم مرتفع في الجزء الأسفل من اللوحات. ب) يبين كثافة مضان في قياس العائد على الاستثمار على مدار الساعة من التجربة، كما خططوا مستوى اللون الرمادي في العائد على الاستثمار (وليس تطبيع). السهم الأسود تسليط الضوء على timepoint من photobleach الأولية والسهم الأخضر يشير إلى بداية photobleaching المتكررة. ΔF يشير اله زيادة في مضان لوحظ خلال فترة الانتعاش، وذلك بسبب ادراج SEP-GluA2 إلى رمح شجيري. انخفاض الرقم الهيدروجيني لاحق ودرجة الحموضة 7.4 + يغسل الكلور NH ₄ تؤكد أن مضان تعافى تتعلق السطح المستقبلات التي أعرب عنها.

الشكل 3. إعادة تدوير وإعادة تدوير الوحشي ضد نشر SEP-GluK2 على جذع شجيري بعد العلاج cyclohexamide

أ) الخلايا العصبية الحصين معربا عن SEP-GluK2، photobleached انتقائي مع FRAP الموازية والبروتوكولات الانتعاش 'FRAP-FLIP' يقوم على طول رويس شجيري منفصلة. وكانت هذه الخلايا العصبية تخضع لمعالجة مسبقة مع cyclohexamide، لمنع تصنيع البروتين (2 ساعة على 200 ميكروغرام / مل). التخطيطي يوضح منطقة التغصنات التي تم تصويرها، في حين أن لوحة اليد اليسرى تسليط الضوء على رويس التي تم اختيارها لphotobleaching. التم تبييض ه كبير منطقة محاصر أبيض مرة واحدة، تليها المتكررة تبييض المناطق المحيطة محاصر، لانخفاض التغصنات فقط، سلط الضوء مع ضعف الأسهم الزرقاء برئاسة. هذه اللوحة تظهر التشعبات قبل photobleaching. السهام الحمراء تسليط الضوء على رويس معروضة في التكبير العالية في B) مما يدل على انتعاش مضان في FRAP التقليدية مقابل البروتوكول "FRAP-FLIP '. مقارنات بين مستويات كثافة مضان في مرحلة متأخرة من الانتعاش (لوحات 3) إظهار مساهمة انتشار الأفقي وإعادة التدوير مقابل إعادة التدوير وحدها. C) ويبين كثافة مضان في رويس قياسها على مدار الساعة من التجربة، كما خططوا كثافة تطبيع القيم. السهم الأسود تسليط الضوء على timepoint من photobleach الأولية والسهم الأخضر يشير إلى بداية photobleaching المتكررة. ΔF _تفصيل يشير إلى انتعاش عابر بسبب مستقبلات إعادة التدوير، تحديد من التغصنات FRAP / FLIP بينما ΔFفرق يقيس مساهمة نشر الوحشي للSEP-GluK2 إلى رمح شجيري في 'FRAP فقط "العائد على الاستثمار. ويتبع هذه الزيادة من قبل عابر انخفاض تدريجي في إشارة، الموافق على المدى نزولا من المستقبلات المتاحة نتيجة للمعاملة cyclohexamide. درجة الحموضة لاحق منخفضة ودرجة الحموضة 7.4 + يغسل NH كلور ₄ تؤكد أن مضان تعافى تتعلق السطح المستقبلات التي أعرب عنها.

Discussion

وصفنا ووضع استراتيجية مبتكرة لتصور مكونات غشاء البلازما الاتجار البروتين. النهج التوافقي من photobleaching التقنيات مع بروتين سبتمبر الموسومة تمكن بشكل انتقائي على أن يقسم الأحداث البلازما الإدراج غشاء. بواسطة photobleaching باستمرار بروتينات غشاء في المناطق المحيطة أثناء الانتعاش، وهي طريقة "FRAP-FLIP 'يقيم مساهمة الاتجار حويصلي إلى انتعاش مضان. هذا النهج الجديد يسمح للتسجيل المباشر لإدخال غشاء من البروتين، وتمكين كل من عدد من الغرف الفرعية حيث لوحظ انتعاش واتساع الانتعاش (ΔF) في حالة مستقرة يحدد لاحقا. كذلك، مقارنة مع FRAP ودون FLIP يسمح نسبة الانتعاش يعزى إلى انتشار الأفقي يتم حسابها.

وعلاوة على ذلك، في التجربة ذاتها، ويمكن مناطق غير photobleached التغصنات المتاخمة للمناطق المحيطة photobleached تكونتقييم نوعيا خلال الانتعاش، وفقدان مضان لوحظ في هذه المناطق سوف يكون راجعا إلى نشر الوحشي للمستقبلات photobleached في هذه القطاعات غير photobleached من التغصنات.

ويمكن استخدام هذا البروتوكول انتقائي photobleaching للتحقيق في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية مثل الاتجار تميز excocytosis في غشاء البلازما في المناطق الفرعية محددة (على سبيل المثال التشعبات أو العمود الفقري،) FRAP أو تقييم مساهمة الجانبي نشر الإدراج مقابل عن طريق إجراء FRAP متوازية و' -FLIP 'البروتوكولات على طول التشعبات المجاورة (الشكل 3).

بوضوح، في حين تم تقديم مبادئ توجيهية محددة، وسوف تحتاج إلى كل مختبر تحسين المعلمات التصوير وفقا لنماذج محددة والمعدات. الأهم من ذلك، كل المستقبلات السطحية في العائد على الاستثمار تحتاج إلى أن تكون photobleached، مستقلة عن الطائرة Z-محور التركيز، ولكن دون وقوع خسائر كبيرة الضوئية أو photobleaching غير محددة. لناوينبغي توخي الحذر المتطلبات البيئية عند محاولة هذا البروتوكول في وسوما الخلية، حيث أن نسبة عالية من مقصورات درجة الحموضة منخفضة نسبيا داخل الخلايا عادة النتائج في مضان خلفية عالية في هذه المناطق. وعلاوة على ذلك، في حين أننا أظهرنا كيف يمكن تطبيق هذه التقنية في تختلف طرق، قبل البدء انتقائية التجارب photobleaching على جديد سبتمبر الموسومة بناء، فإننا ننصح أن تتم أولا إلى توصيف الأولي للمستقبلات المفتاحية، كما وصفها آشبي وآخرون ^2.

وعموما، هذا الأسلوب هو التكيف مع قوة وتنوعا من بروتوكول FRAP القياسية، تمكن أحداث الإدراج في غشاء البلازما التي يتم تقييمها في الوقت الحقيقي القريب.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
coverslips زجاج 24MM	VWR الدولية	631-0161
بولي-L-يسين	سيجما	P2636	1mg/ml في عازلة بورات إلى coverslips معطف
متوسطة Neurobasal	إينفيتروجن	21103
B27	إينفيتروجن	17504-044	2٪ في تصفيح العصبية وتغذية المتوسطة
البنسلين الستربتوميسين	سيجما	P0781	متوسط ​​1٪ في تصفيح العصبية وتغذية
L-الجلوتامين	إينفيتروجن	25030	2MM / 0.8mM في طلاء / تغذية المتوسطة
حصان المصل	Biosera	DH-291H	10٪ في وسائل الاعلام طلاء الخلايا العصبية فقط
pSIN ناقلات الاستنساخ ReP5	إينفيتروجن	K75001	للحصول على إنتاج فيروس سندبيس
LSM510 نظام META مبائر	زييس
صورة J برامج	المعاهد الوطنية للصحة		برامج الوصول المفتوحة. جميع الإضافات الموصوفة هنا متاحة في http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/