Method Article
このレポートでは、ニューロンの細胞膜に発現する外因性、pH感受性GFPタグ融合タンパク質の表面発現、輸送経路や人身売買の速度を決定するための生細胞イメージングと光退色技術の使用について説明します。
1。細胞培養、ウイルス伝達、およびタンパク質発現
2。 FRAP-FLIP生細胞イメージング
3。データ解析
4。代表的な結果
典型的なFRAP-FLIP実験の結果は、図に示されています。 2。ここでは、9月でタグ付けのAMPA型グルタミン酸受容体のサブユニットGluA2を表現するニューロンが選択的に樹状突起の領域に沿って退色しています。図2.Aは、イメージングと(ホワイトボックス領域)退色のために選択されているROIを示していますされている樹状突起の領域を示しています。番目の電子大きな白いボックス領域が二重に向かっ青矢印で強調表示された隣接するボックス領域の漂白繰り返し、続いて一回漂白されました。赤い矢印が下のパネルで高倍率に示すように、測定されたROIを示しています。
図2.Bは、実験の時間経過とともに測定したROI内の蛍光強度を示しています。この例では、1分間の回復期間は無漂白の受容体は横方向の拡散によってROIを入力できるようにするための最初の光退色後に記録した。フランキング領域を退色されている場合、受容体のこの非常に運動性の画分からの蛍光シグナルは、中央領域から遮蔽されており、地域内のものは外で希釈されています。 "FLIP"シーケンスにわたって観察蛍光(ΔF)の増加は、したがって、樹状シャフトのSEP-GluA2の挿入に起因することができます。低pHの洗浄とpH 7.4 +塩化アンモニウムに加え、それぞれ測定した蛍光は、表面から導出されていることを確認タンパク質や測定ROI内の細胞、隔離タンパク質の割合を明らかにした。
FRAPとは対照的に、この方法論は退色領域の蛍光の回復を大幅に低減レベル、その結果、エキソサイトーシスによる回復を分離します。ない信頼性の数学的モデルを常にないようにすると、この選択的な漂白技術を使用して記録された回復トレースを適合し、分析するために開発されました。それはモノ指数回復で回復のトレースに合うように、しかし可能です:
F(T)= S 0 - E(-t /τ)の
F(t)は時刻tでの蛍光である場合には、sは 、定常状態の値である0は時間0でのオフセットで、τは時定数である。回復の伸びは、挿入と拡散の間で定常状態に対応する平衡に到達するために与えられたレートで固定されています。重要なのは、時定数は、このから抽出されたnalysisはエキソサイトーシスの時定数を反映していないだけで個々のタンパク質の比較処理に使用することができます。
また、蛍光回復の予想パターンは、退色領域に沿ってサブドメインで観察される可能性がある。退色セグメント内の小さなROIの分析は、エキソサイトーシス "ホットスポット"を明らかにするために不可欠である可能性があり、それは計算速度に影響を与える樹状突起の間でこれらのスポットの密度のばらつきと同程度の長さの領域を解析することをお勧めします。
図3は、ビューのフィールドに複数の樹状突起を持つ大規模なセクションのROIに光退色を適用し、このプロトコルの拡張を示しています、1つだけの樹状突起の漂白選択の繰り返しが続く。このアプローチは、従来の "FRAP"と並行して取得するための "FRAP-FLIPのデータを有効にします。この例では、海馬ニューロンは、カイニン酸クラスのグルタミン酸受容体サブユニットに感染している。GluK2 SEP-タグが付けられます。 PRIOrは、イメージング、これらのニューロンは、されたタンパク質合成をブロックするために、cylcohexamide(200μg/mlで約2時間)で処理した。それぞれの測定されたROI(図3.B)のような、蛍光回復としては、 "FRAP-FLIP 'プロトコルに受ける樹状突起に単独でリサイクル対標準FRAPの樹状突起の側方拡散やリサイクルによる回収の割合を明らかにする。 FRAP対"FRAP-FLIP"の回復曲線からΔF値を比較し、リサイクル(ΔFREC = 11.05パーセント)対側方拡散(ΔF のdiff = 9.35パーセント)の相対的な寄与を推測することができます。図2とは異なり、回復はタンパク質合成の阻害に起因するではなく、定常状態のレベルを維持していませんが、観察可能な受容体プールの枯渇(に相当する約20%減少し、信号の一時的増加、ドロップオフ、後続を示しています。記録期間)。
図1。FRAP FRAP VS-FLIPプロトコルのプリンシパルの模式図この図は、SEP-タグ付き受容体を使用して、 "FRAP-FLIP 'プロトコルに対する定期的なFRAPの成果を示しています。従来のFRAPの蛍光回復が左側に表示されます。中央のROIの測定蛍光回復は、リサイクルおよび/ または樹状シャフトにde novoのエキソサイトーシスを介して退色ROIと受容体の挿入、外部からの側方拡散fは非退色SEP-タグ付き受容体の組み合わせに起因しています。対照的に、右側に示す隣接するROIの反復的な退色は、横方向に拡散するためにどのようにこの更新 "FRAP-FLIP 'プロトコル無音の回復を示しています。このように、任意の測定した蛍光の回復がROIの直接挿入に起因することができます。
図2。樹状突起軸に細胞膜にSEP-GluA2の挿入
A)SEP-GluA2を発現している海馬のニューロンは、選択的に樹状突起の領域に沿って退色。回路図は、左上のパネルには、退色のために選択されているROIを浮き彫りにしながら、撮像された樹状突起の領域を示しています。大きな白いボックス領域が二重に向かっ青い矢印で強調表示され、隣接するボックス領域の漂白繰り返し、続いて一回漂白されました。このパネルには、退色する前に樹状突起を示しています。赤い矢印が下のパネルで高倍率に示すように、測定されたROIを示しています。 B)実験の時間経過とともに測定したROI内の蛍光強度、ROI内のグレーレベル(正規化されていない)としてプロットを示しています。黒い矢印のハイライトは、初期の光退色と緑色の矢印のタイムポイントは、繰り返し退色の開始を示します。 ΔFは、THを示します。樹状シャフトにSEP-GluA2の挿入による回復期間中に観察され蛍光のe増加しました。その後の低pHとpH 7.4 + NH 4 Clの洗浄、回収蛍光が発現して受容体を表面に関連していることを確認します。
図3シクロヘキ治療後の樹状突起軸にリサイクル&SEP-GluK2の横方向の拡散対のリサイクル
A)海馬ニューロンは並列FRAPと独立した樹状ROIをに沿って実行"FRAP-FLIPの回復プロトコルと選択的に退色SEP-GluK2を発現する。このニューロンは(200μg/ mlの2時間)タンパク質合成をブロックするために、シクロヘキサミドによる前処理の対象となった。回路図は、左側のパネルには、退色のために選択されているROIを強調しながら、撮像された樹状突起の領域を示しています。番目の電子大きな白いボックス領域が二重に向かっ青矢印で強調表示された唯一の低樹状突起の隣接ボックスの領域、の漂白繰り返し、続いて一回漂白されました。このパネルは、前の退色への樹状突起を示しています。赤い矢印は"FRAP-FLIP 'プロトコルと従来のFRAPの蛍光回復を示す)Bで高倍率に示すように、ROIを強調表示します。回復の後期(第三パネル)における蛍光強度のレベルの比較だけではリサイクル対側方拡散やリサイクルの寄与を示しています。C)は、実験の時間経過とともに測定したROI内の蛍光強度を示し、正規化強度としてプロット値を示します。黒い矢印のハイライトは、初期の光退色と緑色の矢印のタイムポイントは、繰り返し退色の開始を示します。 ΔFRECは FRAP / FLIP樹状突起から決定受容体のリサイクルのために一時的な回復を示し、一方、ΔFdiff 'はFRAPのみ"に樹状軸にROIをSEP-GluK2の側方拡散の寄与を測定します。一時的な増加は、シクロヘキ治療の結果として利用できる受容体のダウンの実行に対応する信号が徐々に減少し、続いています。その後の低pHとpH 7.4 + NH 4 Clの洗浄、回収蛍光が発現して受容体を表面に関連していることを確認します。
我々は、原形質膜タンパク質輸送のコンポーネントを可視化する革新的な戦略について説明します。 SEP-tagタンパク質の退色技術のコンビナトリアルアプローチは、細胞膜の挿入イベントを評価することを選択できます。継続的に回復中にフランキング領域で膜タンパク質を退色することにより、 "FRAP-FLIP 'メソッドは蛍光回復への小胞輸送の寄与を評価しています。この新しいアプローチは、決定される定常状態での回復が観察されたサブコンパートメントの数と回復(ΔF)の振幅の両方を有効にすると、タンパク質の膜挿入の直接録音することができます。さらに、FLIPの有無にかかわらずFRAPの比較が計算される横方向の拡散への回復の割合が起因することができます。
また、同じ実験では、隣接退色領域に隣接する非退色樹状突起の領域は、することができます質的に回復中に評価、これらの地域で観察された蛍光損失が樹状突起のこれらの非退色セグメントに退色受容体の側方拡散に起因します。
この選択退色プロトコルはそのような(例えば、樹状突起または棘)またはパラレルFRAPを行うことにより、横方向の拡散対挿入の寄与を評価し、 "FRAP定義されているサブ領域で細胞膜にexcocytosisを特徴づけるように細胞輸送過程の様々な調査をするために利用することができます。隣接した樹状突起に沿って、FLIP "プロトコル(図3)。
具体的なガイドラインが提示されてきたが、明らかに、各ラボでは、特定の標本や機器に係る撮像パラメータを最適化する必要があります。重要なのは、ROI内のすべての表面受容体は、退色z軸焦点面の独立したが、かなり光毒性損傷または非特定の退色せずにしておく必要があります。私達細胞体では、このプロトコルをしようとすると、ERSは、これらの地域では比較的低pH細胞内区画高いバックグラウンド蛍光の典型的結果の割合が高いので、注意が必要です。また、事前に選択的光退色実験を開始する、方法を変える我々はこの技術がどのように適用できるかを実証した一方で新しいSEP-タグ付きの構築、我々は、タグ付き受容体の初期特性は、最初アシュビーらによって前述のように、行われることをお勧めし2。
全体的に、このメソッドは、ほぼリアルタイムで評価される細胞膜に挿入イベントを有効にすると、標準FRAPプロトコルの強力かつ汎用性の高い適応したものです。
利害の衝突が宣言されません。
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名前会社概要カタログ番号コメント(オプション) 1mg/ml 2% 1% 2mMの/ 0.8mmの 10%のみ
Name | Company | Catalog Number | Comments |
24ミリメートルカバーガラス | VWRインターナショナル | 631-0161 | |
ポリ-L-リジン | シグマ | P2636 | |
Neurobasal中 | インビトロジェン | 21103 | |
B27 | インビトロジェン | 17504-044 | |
ペニシリンストレプトマイシン | シグマ | P0781 | |
L-グルタミン | インビトロジェン | 25030 | |
ウマ血清 | Biosera | DH-291H | |
pSIN ReP5クローニングベクター | インビトロジェン | K75001 | シンドビスウイルス産生のために |
LSM510 META共焦点システム | ツァイス | ||
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