Боковая диффузия и экзоцитоз мембранных белков в культивируемых нейронов оценивали по флуоресценции и флуоресценции восстановления потерь фотообесцвечивания

Резюме

В настоящем докладе описывается использование живых клеток и photobleach методы определения поверхностной экспрессии, транспортные пути и торговли кинетики экзогенно выражается, рН-чувствительные GFP-меченных белков в мембране нейронов.

Аннотация

протокол

1. Культуры клеток, вирусная трансдукция и экспрессии белка

1. Культура высокая плотность нейронов гиппокампа крысы из эмбриональных день 18 (E18) детенышей на поли-L-лизин-покровные стекла с покрытием на 14-25 дней в пробирке (DIV).
2. 6-24 часа до живых экспериментов, трансдукции клеток с вирусом ослабленный Синдбис содержащих мембранный белок, с меткой супер-эклиптики pHluorin (SEP).
3. Добавить pseudovirion среде, содержащей непосредственно к покровным содержащих 1 мл условных средств массовой информации и вернулся к культуре инкубатора. Титр и времени для экспрессии белка после вирусной трансдукции будет варьироваться в зависимости от вирусов и партии должны быть определены для каждой партии перед началом экспериментов живых клеток.

2. FRAP-FLIP живых клеток

1. Оборудование настройки
   1. Передача покровное на изображение камеры Zeiss Axiovert LSM 510 META конфокальной микроскопии.Чтобы свести к минимуму колебания мощности во время съемки, убедитесь, что микроскоп был включен, при 100% выходной мощности лазера, по крайней мере 20 минут до начала съемки.
   2. Немедленно замените питательную среду с предварительно нагретым (37 ° C) внеклеточный раствор содержащий записи 140 мм NaCl, 5 мМ KCl, 15 мМ глюкозы, 1,5 мМ CaCl _2, 1,5 мМ MgCl _2, 20-25 мм HEPES (рН до 7.4 с NaOH) и поместить камеру на предварительно нагретую этап (37 ° С) Zeiss Axiovert.
      
      Убедитесь, что осмолярность внеклеточной решение записи настраивается в пределах 10 мосм вашей питательной среде. При условии, никаких существенных испарение происходит во время timecourse эксперимента, это CO ₂ самостоятельное решение подходит для коротких экспериментов (<10 часов). Дополнение 1-2 мМ бикарбоната натрия рекомендуется.
2. Определение параметров изображения захвата
   1. Во-первых, определите, нейрон выражения рекомбинантного пробелка интересов и привести его в фокусе.
   2. С 63x нефти возражал, получить изображение всей ячейки с помощью 488nm возбуждения лазерного излучения при малой мощности лазера. Чтобы свести к минимуму фотообесцвечивания, использовать быстрый номинальной скорости (7-9) и низкое разрешение пикселей (512-512), сохраняя общую скорость сканирования <1 секунды.
   3. Выберите часть дендритов к изображению и масштабирование для захвата кадра, содержащего ROI (~ 1,5-2,5-кратный оптический зум). Где это возможно, обеспечить поле зрения есть несколько процессов, с тем, что измерения с ссылкой дендритов может быть получен, чтобы определить, неспецифические фотообесцвечивания в связи с приобретением происходит.
   4. Настройте фильтры, отверстия, скорости сканирования и усиления детектора включить максимальные флуоресценции от минимального возбуждения лазера, но с ограниченным насыщения. Большой диаметр отверстия рекомендуется, чтобы максимально фотон коллекции (2 мкм подходит для шипов и тройных дендритов). Детектор усиление должно быть достаточно сильным, чтобы обнаружить небольшие флуоресценции шагом,такой, что первые изображения, до фотообесцвечивания не преодолеть 10% насыщенных пикселов.
   5. Сохранение такой конфигурации, которые будут использоваться для предварительного / после отбеливания и восстановления после эксперимента.
   6. Затем определите photobleach регионов, выбор ROI для начальной photobleach и фланговые регионах для последующего повторного этапа фотообесцвечивания. Убедитесь, что фланговые области достаточно широки, чтобы предотвратить восстановление путем диффузии между запусками (обычно 5 мкм, см. рис. 2).
   7. Настройте параметры отбеливатель для photobleach ROI. Начальная photobleach должна быть быстрой (0,1-0,5 сек) требует 1-5 итераций, в зависимости от оптического зума и объем ROI. Для флангового регионов, лазерного возбуждения должна быть скорректирована для обеспечения непрерывной фотообесцвечивания фланговых районах, но без фототоксических повреждения.
   8. В качестве ориентира мы используем 100% лазерного возбуждения для начальной photobleach, и 10% для повторяющихся фотообесцвечивания телазы.
3. Изображение приобретение
   1. После того как все параметры были установлены, выполните FRAP-FLIP эксперименте в качестве переменной покадровой последовательности изображений, которые изложены в 4-х блоков ниже:
      
      Блок 1: 3-10 предварительной отбеливатель изображения базовой линии, при малой мощности лазера, нет времени задержки
      Блок 2: Photobleach центральной ROI на полную мощность лазера, 1-5 итераций
      Блок 3: 3-10 после отбеливания изображений восстановления
      Блок 4: Повторяющиеся photobleach обходных регионов на средней мощности лазерного излучения с захвата изображения на типичный промежуток времени от 1 - 5 секунд, в зависимости от скорости восстановления белка под следствием.
   2. Наконец, замените внеклеточный раствор записи с записью на буферный раствор pH6 содержащих 140 мм NaCl, 5 мМ KCl, 15 мм глюкозы, 1,5 мМ CaCl _2, 1,5 мМ MgCl _2, 20-25 мм МЧС (чтобы утолить флуоресценции) или дополнен 50 мМ NH4Cl с 90 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 15 мМ глюкозы, 1,8 мМ CaCl _2, 0,8 ммMgCl _2, 20-25 мм HEPES, pH7.4 (для выявления белков в странах с низким рН внутриклеточных депо), (см. рис. 2).
   3. Соберите по крайней мере, от 10 до 20 наборов данных для каждого рекомбинантного белка, чтобы дать возможность статистического анализа. Чтобы избежать смещения результатов, обеспечить условия изображения сохраняются последовательно через репликацию. Откажитесь от любого наборы данных, где неполное отбеливание, значительный дрейф координационного самолета или фототоксических повреждения клеток не наблюдается.

3. Анализ данных

1. Откройте изображение с помощью программного обеспечения ImageJ.
2. Совместите стеки составляют небольшие колебания в плоскости х, которые могли иметь место на протяжении всего времени использования серии Stackreg плагин (плагины → → stackreg преобразования: твердое тело → ).
3. Для изображений, снятых на Zeiss конфокальной, использовать плагин LSM панели инструментов, чтобы сообщить о времени значения в виде текстового файла (плагинов → Инструменты → LSM LSM Показать Инструменты → → )и импортировать эти значения в анализе таблицы.
4. Чтобы измерить флуктуации флуоресценции в FRAP-FLIP эксперимент, разделить photobleached сегмента в отдельных регионах пикселов (~ 20pixels) и измерять среднюю флуоресценции этих трансформирования в каждый момент времени (F). Чтобы быстро получить эти значения, выбрать несколько трансформирования использовании инструмент анализа ImageJ "ROI Менеджер" (Анализ → Инструменты → ROI Manager) и сообщить о средней флуоресценции на пиксель с помощью "Участок Z-оси профиль" команду (Image → стеки → Участок Z оси профиля).
5. Повторите этот шаг для измерения интенсивности флуоресценции фон, не люминесцентные региона.
6. Нормализация интенсивности флуоресценции в каждый момент времени путем вычитания фоновых значений для удаления экспериментального шума, и разделить все значения на среднее предварительно отбеленные базовые меры.
7. Измерить интенсивность флуоресценции смежных без photobleached дендритов для оценки уровня неспецифическойфотообесцвечивания во время приобретения. Коррекция неспецифических фотообесцвечивания не рекомендуется для интерпретации "FRAP-FLIP" данных и должны быть по возможности избегать.
8. Чтобы вычислить, если значительный подъем произошел в ROI, вычесть среднее за последние 5-10 меры последовательности от среднего первые 5-10 мер (ΔF) и определить статистическую значимость. Классифицировать восстановления и не восстанавливается трансформирования оценить структуру экзоцитоза (то есть горячие экзоцитоза или позвоночника вал против восстановления).

4. Представитель Результаты

Результаты типичного FRAP-FLIP эксперимента приведена на рис. 2. Здесь нейрон выражения GluA2 субъединицы АМРА типа глутамата рецепторов, помеченные СЕП были выборочно photobleached по области дендритов. Рис 2.А иллюстрирует области дендритов, которая была образа диска и показывает трансформирования, которые были выбраны для фотообесцвечивания (белые области окна). Thэлектронная большой белой коробке области было отбеливать раз, после повторного отбеливания фланговые коробку регионов, выделенный двуглавый синими стрелками. Красная стрелка указывает измеренный ROI, как показано на большом увеличении в нижней панели.

2.В рис, показывает интенсивность флуоресценции в измеренных ROI за время хода эксперимента. В этом примере одной минуты восстановительного периода был зафиксирован после первого photobleach чтобы небеленой рецепторы, чтобы войти в ROI на боковой диффузии. Когда фланговые регионов photobleached, сигнал флуоресценции от этого очень подвижны долю рецепторов окклюзии из центральной области, а те, в регионе разводят из. Увеличение флуоресценции (ΔF) наблюдать за "FLIP" последовательность Таким образом, можно объяснить включением SEP-GluA2 в дендритных вала. Низкий рН мытья и рН 7,4 + NH4Cl дополнение соответственно подтвердить, что измеряется флуоресценции происходит от поверхностибелки и выявить долю внутриклеточных, поглощенных белков в измеренных ROI.

В отличие от FRAP, эта методология изолирует восстановления из-за экзоцитоза, в результате чего значительно снижается уровень флуоресценции восстановления photobleached региона. На сегодняшний день нет достоверной математической модели была разработана, чтобы соответствовать и анализировать следы восстановления, записанные с помощью этого избирательного отбеливания технику. Это, однако, возможно, чтобы соответствовать восстановления следа с моно экспоненциальный восстановления:

F _(T) = _х - _{0 ^} ^{(-T / τ)}

Где F _(T) флуоресценции на время т, _с устойчиво государственного значения, ₀ смещение в момент 0, τ является постоянной времени. Восстановительный рост зафиксирован с заданной скоростью для достижения равновесия, соответствующего стационарного состояния между вставкой и диффузии. Важно отметить, что постоянная времени извлечь из этогоНАЛИЗ не отражает постоянную времени экзоцитоза и может быть использован только для сравнительного лечения отдельных белков.

Кроме того, ожидается картины флуоресценции восстановление, вероятно, будет наблюдаться в суб-доменов по photobleached региона. Анализ рентабельности в пределах небольшой photobleached сегмент может иметь важное значение для экзоцитоза выявить "горячие точки", и желательно, чтобы проанализировать регионов сопоставимой длины, как изменчивость плотности этих мест среди дендритов повлияет на расчетную скорость.

Рисунок 3 показывает расширение этого протокола, применяя photobleach большим ROI раздел с несколькими дендритов в поле зрения, после селективного повторного отбеливания только один дендрит. Такой подход позволяет традиционной "FRAP» и «FRAP-FLIP" данные, которые будут приобретены одновременно. В этом примере нейронов гиппокампа были инфицированы глутамата субъединицы рецептора каинат класса, SEP-меченый GluK2. Prioг к визуализации, эти нейроны, лечили cylcohexamide (2 часа в 200μg/ml), чтобы блокировать синтез белка. Таким образом, восстановление флуоресценции в соответствующих измеряемых трансформирования (рис. 3.В) показывает долю восстановления в связи с боковой диффузии и утилизации в стандартном дендритов FRAP против переработки только в дендритных подвергаются "FRAP-FLIP" протокол. Сравнивая значения ΔF 'FRAP-FLIP "восстановление FRAP по сравнению с кривыми, относительный вклад утилизации (ΔF _гес = 11,05%) по сравнению с боковой диффузией _(разн. ΔF = 9,35%) может быть выведено. В отличие от рис 2, восстановлению не поддерживать постоянный уровень государства, но, скорее, за счет ингибирования синтеза белков, показывает, преходящее повышение и последующее высадки в сигнал, соответствующий истощение имеющихся бассейн рецепторов (около 20% снижение наблюдается за учетный период).

Рисунок 1. Схема принципы FRAP против FRAP-FLIP протоколов Эта схема иллюстрирует результаты регулярного FRAP по сравнению с протоколом "FRAP-FLIP, использование SEP-меченый рецепторов. Флуоресценции восстановления традиционных FRAP показано на левой стороне. Измерения флуоресценции восстановления в центральной рентабельности объясняется сочетанием латеральной диффузии е, не photobleached SEP-меченый рецепторов извне photobleached ROI и вставки рецепторов за счет рециркуляции и / или заново экзоцитоза в дендритных вала. В отличие от повторяющихся photobleached из фланговых трансформирования показано в правой части, показывает, как "FRAP-FLIP" Этот измененный протокол молчание восстановления в связи с боковой диффузии. Таким образом, любой измеренной восстановления флуоресценции можно отнести к прямым включения в ROI.

Рисунок 2.Введение SEP-GluA2 в мембране на дендритных вал

А) нейронов гиппокампа выражения SEP-GluA2, избирательно photobleached по области дендритов. Схема иллюстрирует области дендритов, которая была отображаемого, а в верхней левой панели подчеркивает трансформирования, которые были выбраны для фотообесцвечивания. Большой белый коробку области была отбеливать раз, а затем повторные отбеливания фланговые коробку регионов, выделенный двуглавый синими стрелками. Эта панель показывает дендрита до фотообесцвечивания. Красная стрелка указывает измеренный ROI, как показано на большом увеличении в нижней панели. B) показывает интенсивность флуоресценции в измеренных ROI за время хода эксперимента, построенные в виде серых уровня ROI (не нормируется). Черная стрелка выделить timepoint начальной photobleach и зеленая стрелка указывает на начало повторяющиеся фотообесцвечивания. ΔF указывает йэлектронного увеличения флуоресценции, наблюдаемые на протяжении восстановительного периода, в связи с включением SEP-GluA2 в дендритных вала. Последующие низким рН и рН 7,4 + NH ₄ Cl моет подтвердить, что восстановленные флуоресценции относится к поверхностным рецепторам выражено.

Рисунок 3. Утилизация и переработка боковой против распространения SEP-GluK2 на дендритных вала после лечения cyclohexamide

А) нейронов гиппокампа выражения SEP-GluK2, избирательно photobleached с параллельным FRAP и «FRAP-FLIP" восстановление протоколов осуществляется по отдельным дендритных ROI. Этот нейрон подвергается предварительной обработке с cyclohexamide, блокировать синтез белка (2 часа при 200 мкг / мл). Схема иллюстрирует области дендритов, которая была отображаемого, а левой панели подчеркивает трансформирования, которые были выбраны для фотообесцвечивания. Thэлектронная большой белой коробке области было отбеливать раз, после повторного отбеливания фланговые коробку регионов, нижней дендритов только выделенный двуглавый синими стрелками. Эта панель показывает дендритов до фотообесцвечивания. Красными стрелками выделить трансформирования показан на большом увеличении в B), иллюстрирующие флуоресценции восстановления традиционных FRAP по сравнению с протоколом "FRAP-FLIP. Сравнение уровней интенсивности флуоресценции в поздней стадии восстановления (третья панель) показать вклад латеральной диффузии и утилизации против утилизации в одиночку. C) показывает интенсивность флуоресценции в измеренных трансформирования за время хода эксперимента, построенные, как нормированная интенсивность значения. Черная стрелка выделить timepoint начальной photobleach и зеленая стрелка указывает на начало повторяющиеся фотообесцвечивания. ΔF _{рекомендация} указывает на переходный восстановления в связи с рецептором переработки, определяется из FRAP / FLIP дендритов в то время как ΔFразн. измеряет вклад латеральной диффузии SEP-GluK2 в дендритных вал в «FRAP только« ROI. Преходящее повышение сопровождается постепенным снижением сигнал, соответствующий ходу вниз доступных рецепторов в результате cyclohexamide лечения. Последующие низким рН и рН 7,4 + NH ₄ Cl моет подтвердить, что восстановленные флуоресценции относится к поверхностным рецепторам выражено.

Обсуждение

Мы описываем инновационной стратегии для визуализации компонентов плазмы торговли белковой оболочки. Комбинаторный подход фотообесцвечивания техники с SEP-меченый белок плазмы позволяет выборочно события мембраны вставки в оценке. Постоянно фотообесцвечивания мембранных белков в фланговые регионов во время восстановления, метод «FRAP-FLIP" оценивает вклад везикулярного торговли людьми флуоресценции восстановления. Этот новый подход позволяет осуществлять прямую запись белка вставки мембраны, что позволяет как количество суб-купе, где наблюдается восстановление и амплитуда восстановления (ΔF) в устойчивое состояние не определено. Кроме того, сравнение FRAP и без FLIP позволяет доля восстановление связано с боковой диффузии рассчитывается.

Кроме того, в одном эксперименте, регионы, не photobleached дендритов, прилегающих к фланговой photobleached регионах может бытькачественно оценить во время восстановления; флуоресценции потери наблюдаются в этих регионах будет происходить за счет боковой диффузии photobleached рецепторов в этих не photobleached сегменты дендритов.

Такое избирательное фотообесцвечивания протокол может быть использован для исследования различных клеточных процессов, таких как торговля характеризующие excocytosis в мембране в определенной подобласти (например, дендриты или шипами) или оценке вклада боковой вставкой против диффузии путем проведения параллельного FRAP и «FRAP -FLIP "протоколов по смежные дендритов (рис. 3).

Очевидно, что в то время как конкретные рекомендации были представлены, каждая лаборатория необходимо оптимизировать параметры изображения в зависимости от конкретных образцов и оборудования. Важно отметить, что все поверхностные рецепторы в ROI должен быть photobleached, независимо от оси фокальной плоскости, но без существенного ущерба или фототоксических неспецифические фотообесцвечивания. НамERS следует проявлять осторожность при попытке этого протокола в клетке сомы, как высокий процент относительно низким рН внутриклеточных отсеков обычно приводит к флуоресценции фона в этих регионах. Кроме того, в то время как мы показали, как этот метод может быть применен в варьирует пути, до начала избирательный фотообесцвечивания эксперименты на новом SEP-меченый построить, мы советуем, что начальная характеристика помеченные рецепторов впервые проводились, как описано Эшби и др. ^2.

В целом, этот метод является мощным и универсальным адаптация стандартного протокола FRAP, что позволяет вставки событий в мембране должны быть оценены в режиме реального времени.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 мм покровные стекла	VWR International	631-0161
Поли-L-лизин	Sigma	P2636	1mg/ml в боратном буфере, чтобы покрыть покровные
Neurobasal среднего	Invitrogen	21 103
B27	Invitrogen	17504-044	2% нейронов покрытие и кормления средние
Пенициллин стрептомицин	Sigma	P0781	1% нейронов покрытие и кормления средние
L-глютамин	Invitrogen	25 030	2 мм / 0,8 мм в посеве / кормления средних
Лошадиной сыворотки	Biosera	DH-291H	10% нейронов в средствах массовой информации только покрытие
PSIN ReP5 клонирования вектор	Invitrogen	K75001	Для производства вирусов Синдбис
LSM510 META конфокальной системы	Zeiss
Image J Software	NIH		Программное обеспечение с открытым доступом. Все плагины, описанные здесь имеются в Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/